1.4.1均質化培地
細胞破壊は、通常、形態学的完全性を維持するために、わずかに低浸透性または等浸透性培地のいずれかで行われる。 スクロースは、細胞内小器官または小胞が有害な腫脹または収縮を防ぐために浸透圧として一般的に使用される。 マンニトールおよびソルビトールはまたスクロースがsubcellular部品の生化学的な分析と干渉すると見つけられたとき使用されました。 後者は細胞内小器官を凝集させる傾向があるため、ショ糖は塩溶液よりも好ましい。 これらの条件下では、破壊された細胞は大きなゴーストまたはシートの形で原形質膜を生成するため、低浸透圧媒体は、しばしば原形質膜画分の単離に使 これは、遠心分離前のこれらの断片の大きさの高度の変動を有意に減少させる。 均質化培地は通常、本質的には水性であるが、エーテル／クロロホルムのような非水性培地が、細胞内小器官を単離するために使用されてきた。 しかし、非水性媒体は、いくつかの酵素を不活性化し、いくつかの組織の形態学的完全性を低下させる可能性がある。＜６ ６ ２ ７＞＜２ １ ８ ４＞キレート剤（ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）を均質化媒体に添加して、膜プロテアーゼに必要なＭｇ２＋またはＣａ２＋などの二価の陽イオンを除去することができる。 EDTAおよびチオール試薬はいくつかのタンパク質分解酵素を活性化する可能性があるため、プロテアーゼ阻害剤を培地に含めるべきであることに注意することが重要である。 しかしながら、多くの膜マーカー酵素は、活性のためにこれらの陽イオンを必要とし、陽イオンが抽出物から除去された後に阻害され得る。 均質化媒体へのMg2+またはCa2+の添加は、核の完全性を維持する。 しかし、これらのイオンは膜凝集を引き起こし、ミトコンドリアの呼吸制御を低下させる可能性がある。
植物組織の細胞破壊は、多くの場合、植物酵素にいくつかの有害な影響を与えることができるフェノールを放出します。 植物フェノール化合物は、フェニルプロパノイド化合物（例えば加水分解性タンニン）とフラボノイド（例えば凝縮タンニン）の二つの基を本質的に含む。 フェノールは、タンパク質のペプチド結合と水素結合したり、フェノールオキシダーゼによってキノンに酸化されたりすることができる。 キノンはまた植物のティッシュの褐変の基礎を形作るメラニンと呼出される暗い顔料を形作るために蛋白質の反応グループと重合し、凝縮しがち タンパク質へのメラニンの付着は、多くの酵素を不活性化する可能性がある。 フェノール性ヒドロキシル基は，蛋白質の塩基性アミノ酸とイオン相互作用を形成したり，蛋白質の疎水性領域と疎水的に相互作用したりすることがある。 したがって、できるだけ早くフェノール化合物を除去することが重要であり、これは、フェノールまたはキノンに結合する吸着剤を使用するか、フェノールオキシダーゼ活性を阻害するホウ酸塩、ゲルマン酸塩、亜硫酸塩およびメルカプトベンゾチアゾールなどの保護剤を使用することによって最もよく達成される。 フェノール吸着剤には、水溶性形態のポリビニルピロリドン、または高度に架橋された不溶性生成物”ポリクラー”のいずれかを単離培地に添加することがで ポリビニルピロリドンは、タンパク質と強い水素結合を形成するフェノール化合物と結合する。 牛のような血清のアルブミンはまた植物のフェノールと反応するために報告され、また有効なキノンの清掃動物です。
細胞または組織の分画は、膜プロテアーゼの活性を低下させるために常に+4℃で行われる。 プロテアーゼは、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼに細分することができる。 内部ペプチド結合を切断する酵素であるエンドペプチダーゼは、以下を含む：pH2.5–3.8のpH最適を有し、遷移状態阻害剤ペプスタチンによって阻害するこ; れてもよい）；Ｎ−エチルマレイミドまたはＥ−６ ４（ｌ−ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｅ−ｂｕｔａｎｅ）によって阻害されるスルフヒドリルプロテアーゼ；およびＮ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅまたはＥ−６ ４（ｌ−ｔｒａｎｓ−ｅｐｏｘｙｓｕｃｃｉｎｙｌ−ｌｅｕｃｙｌａｍｉｄｅ−ｂｕｔａｎｅ）によって阻害されてもよいスルフヒドリルプロテアーゼ；およびＮ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅまたは エキソペプチダーゼの例には、ほとんどの植物組織に存在し、ほとんどのC末端アミノ酸を容易に加水分解するカルボキシペプチダーゼが含まれる。 これまでに研究されたすべての植物カルボキシペプチダーゼはジイソプロピルフルオロリン酸によって阻害される。 アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、トリペプチダーゼも植物で同定されている。 均質化媒体で使用される他の化合物には、２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、ジチオエリスリトール、還元グルタチオンまたはシステインのようなジスルフィド還元剤が含まれる。 これは、多くの酵素が酵素活性を維持するために還元されたままでなければならない必須の活性部位スルフヒドリル基を含むためである。 オルガネラ単離の問題の多くは、壊れやすい膜、例えば液胞を取り囲むトノプラストの破裂に関連している。 これらの膜の物理的な破壊から離れて、植物のティッシュは膜の脂質の部品を直接攻撃し、オルガネラを破壊できる活動的なlipolytic酵素を含んでいます。 アシルヒドロラーゼの加水分解作用によって放出される遊離脂肪酸は、ミトコンドリア、葉緑体および原形質膜のATPase活性を阻害することができる。 脂肪酸の他の有害な効果も十分に確立されています。 植物におけるリパーゼおよび脂肪分解アシルヒドロラーゼによる脂質分解を減少させることができる特定の条件がある。 これらには、（１）ｐＨ７の単離培地を使用することが含まれる。5-8ほとんどの脂肪分解酵素およびリポオキシゲナーゼがほとんど活性を示さない、(2)多くのホスホリパーゼがCa2+依存性であるためEDTAのようなキレート剤;しかし、多くの脂肪分解酵素はキレート剤によって影響されない、(3)脂肪酸ヒドロペルオキシド、ジスルフィド還元剤、特定の酵素阻害剤および遊離脂肪酸に結合する脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンの使用の酸化分解を防ぐための抗酸化剤のような他の添加物。 個々の均質化培地はそれぞれ異なり、ホスホリパーゼまたはホスファターゼなどの酵素に対する特異的阻害剤を含有していてもよい。 例えば、グリセロールは、ホスファチジン酸ホスファターゼを阻害するために単離培地に添加されることが多い。 エタノールアミンと塩化コリンは、ホスホリパーゼDを阻害するために一般的に使用されています。
植物細胞分画のための均質化培地の緩衝能力は、細胞の実質的な量を構成する破壊された液胞による有機酸の放出を相殺するために高くなければならない。 均質化媒体は、経験的評価または合理的分析のいずれかによって定式化することができる。 例えば、関連する精製されたタンパク質が無傷のままであることを確実にするために、プロテアーゼのすべての主要な阻害剤を均質化培地に添加してもよく、または代替的に生理学的溶液をコピーしてもよい。 植物細胞の細胞質pHは約7.5–8.0であるため、均質化培地は細胞の生理学的状態を反映するはずであり、したがって細胞質pHに弱く緩衝される。