このビデオでは、クロム放出アッセイを実行し、エフェクター細胞の細胞傷害性能
免疫細胞は、がんやウイルスに感染した細胞などの潜在的に有害な細胞を、免疫応答の不可欠な部分である身体から特定し、除去する責任があります。 T細胞やNK細胞のようないくつかの免疫細胞は、標的細胞を同定し、それらの標的細胞のタンパク質分解、溶解、および死を誘導するタンパク質を分泌 細胞傷害性の可能性を定量化することは、免疫細胞の活性化および効力を測定するために重要であり、クロム放出アッセイは、この目的のために一般
この方法は、異なる条件下で特定の種類の免疫細胞によって誘導される細胞毒性を比較することを可能にし、癌免疫療法および免疫関連疾患の研究 開始するには、標的細胞は、癌細胞のように、細胞によって取り込まれる放射性同位体、クロム51、とインキュベートされています。 次に、これらの放射標識された細胞を、エフェクター細胞とも呼ばれる目的の単離された免疫細胞と、丸い底部の96ウェルプレートで共培養して、2つの細胞型間の相互作用を容易にする。
アッセイの全体的なセットアップは、適切なコントロールと一緒に、免疫細胞の濃度が異なる特定の数の標的細胞をインキュベートすることを含む。 共培養は、エフェクター細胞が標的細胞内でアポトーシスおよび溶解を誘導することを可能にし、その結果、細胞内クロム51が上清中に放出される。 次いで、予め最適化された時点で、放出されたクロムを含有する上清を全てのウェルから回収する。 放射性であるクロム51は、自発的にガンマ線を放出するために放射性崩壊を受ける。 アッセイプレート内のすべてのウェルからの上清中のガンマ線レベルは、標的細胞の溶解の定量可能な出力を表す。 これは、免疫細胞の細胞傷害性電位を決定するために使用されるガンマ計数器を使用して測定される。
まず、標的細胞、本実施例におけるヒト黒色腫細胞株WM793を単一細胞懸濁液に調製する。 これを行うには、最初に組織培養フラスコから培地を取り出し、1x PBSの五ミリリットルで細胞を洗浄します。 PBSをデカントし、約二分間プレートにトリプシンの一ミリリットルを追加します。 ゆっくりとフラスコをタップしてフラスコ表面から細胞を緩め、5ミリリットルのRPMI培地をフラスコに加えます。 細胞を集め、15ミリリットルの円錐管にこの懸濁液を加えるために媒体を上下にピペットで縛って下さい。
チューブを遠心分離機に1200RPMで5分間置きます。 次に、細胞の餌を破壊しないことを確かめる管から媒体を取除いて下さい。 穏やかに細胞の餌を破壊し、媒体の10ミリリットルを管に加えるために管の底をフリックして下さい。 それから、穏やかに懸濁液に細胞を持って来るために媒体を上下にピペットで縛って下さい。 次に、血球計を使用して細胞濃度を決定し、新しい15ミリリットル円錐管に元の細胞懸濁液の二ミリリットルを転送します。 管を遠心分離機に置き、5分の12百のRPMで細胞に餌を与えて下さい。 遠心分離の後、余分な媒体を管から廃棄物容器に注ぎます。 短い渦媒体の小さい容積の細胞の餌をresuspendするために管は置き去りにしました。
次に、この特定の放射能専用のラボスペースに移動して、クロム51を使用する準備をします。 クロム51のサンプルがどこに保たれているか示す適切な表記と同様、すべてのステップの間にクロム51の安全な貯蔵そして使用のための十分な鉛 パンケーキ調査が装備されているガイガーカウンターは可能な汚染のためのスペースで役立ってまた必要である。
放射能の適切な使用のためにセットアップされたら、100マイクロクロム51を標的細胞懸濁液に直接加えます。 それから、サンプルおよび管が今放射性であることを示すために管に放射性テープの小さい部分を加えて下さい。 鉛の盾が付いている37の摂氏温度の定温器に管を置き、管を15から20分毎に弾く時間の間孵化させて下さい。
標的細胞が標識されている間、エフェクター細胞の単一細胞懸濁液を調製する。 この実施例では、ヒト末梢血単核細胞、またはＰｄｍｃを、標準密度勾配遠心分離により全血から１ ０〜６回目の５倍の濃度まで単離した。 このエフェクターセル懸濁液を使い捨て試薬リザーバに移し、この懸濁液の200マイクロリットルを96ウェルの丸底板の列Bの各ウェルに加えます。 次に、プレートの列CからGの各ウェルに100マイクロリットルのRPMIを加えます。
次に、PBMCsの連続希釈を開始し、まずB行のウェル内のセルを100マイクロリットル除去し、これをc行に追加することにより、エフェクターセル数の範囲を 行Gに到達したら、その行の各ウェルに100マイクロリットルの最終体積を残すためにウェルから100マイクロリットルを移動します。 次に、エフェクター細胞をこの行に追加すべきではないので、標的細胞からのクロム51の自発的放出のための対照として役立つように、行Aのウェルに100 次に、標的細胞を添加する準備が整うまで、プレートを37℃のインキュベーターに置きます。
インキュベーターから標的細胞を取り出し、5ミリリットルのFBSで洗浄して過剰のクロム51を除去する。 その後、チューブを指定された遠心分離機に入れ、1200rpmで5分間回転させます。 適切な廃棄物容器に放射性FBSの洗浄を取除き、fbsの新しい5ミリリットルの餌をresuspendingによって洗浄ステップを繰り返して下さい。 チューブを指定された遠心分離機に置き、細胞を1200rpmで5分間再び回転させる。 第二の洗浄を削除し、ガイガーカウンターを使用して組み込まれた放射能のためにペレットを確認します。 最後に、完全な媒体の10ミリリットルの餌を再懸濁し、使い捨て可能な試薬の貯蔵所に分類されるクロム51ターゲット細胞の懸濁液を注ぎなさい。 次に、これらの標識された標的細胞の100マイクロリットルを96ウェルエフェクター細胞プレートのすべてのウェルに添加する。 次に、１ ０ ０μ ｌの１％ＮＰ−４ ０をｈ列のウェルに加えて、この各列の全ての標的細胞を溶解させる。 これらのウェルは、毎分の合計カウント、またはcpmを決定するためのコントロールとして使用されます。
プレートが準備されたので、プレートの両側に小さなテープを加えて蓋を固定し、蓋の上に放射性テープを置き、クロム51が含まれていることを示します。 その後、放射性試料を処理するためにマークされた遠心分離機にプレートを置きます。 実験板が1つだけ使用されている場合は、遠心分離機にバランス板を追加します。 遠心分離機を1200のrpmに置き、版を促進するために持って来て下さい。 一度速度で、機械を停止して下さい。 遠心分離機から版を取除いて下さい。 それから、付加的な安全のための版に保護する鉛の小さい部分が付いている37の摂氏温度の定温器に版を置いて下さい。 標的細胞を溶解させるために１ ６時間インキュベートする。
潜伏期間の終わりに、プレートの端の周りのテープを慎重に取り外し、蓋を取り外します。 次に、小さいフィルターディスクが綿のプラグのそれぞれのために所定の位置にあることを確認することを確かめる版に収穫フレームを置きなさい。 今、ゆっくりと静かに綿のプラグを井戸に押してください。 およそ10秒後で、綿のプラグの圧力を解放し、次に綿のプラグを管のストリップに移して下さい。 二次FACSの管にこれらの管のそれぞれを置いて下さい。 最後に、FACSの管をガンマのカウンターに荷を積み、各条件で解放されるクロム51の量を定量するためにサンプルを動かしなさい。 慎重に管がカウンターにロードされた順序を記録します。
ここでは、最初の3レーンに非刺激Pbmcが追加され、cpg刺激Pmbcがレーン4～6に追加されました。 この例では、サンプルが元のプレートに配置され、三重関数の平均が計算されたのと同じ方法で、毎分カウントをスプレッドシートのセルに入力しました。 例えば、第１の条件について、細胞Ａ１、Ａ２、およびＡ３を、細胞Ｉ３において平均化した。 平均値が決定されると、各条件に対する特定の溶解の割合は、この式を使用して計算することができる。 例えば、標的細胞に対する５ ０対１のエフェクター細胞の比を有する非刺激細胞についての特異的溶解率を計算するために、この実施例では１ １ ６ ４． 67. 次いで、この数を最大ＣＰＭと自発ＣＰＭとの間の差で除算し、次いで１ ０ ０を掛けて、特定の溶解率を与えることができる。 これは、各条件に対して計算されます。 次いで、これらのデータをグラフ化して、非刺激ＰｂｍｃおよびＣＰＧ刺激Ｐｂｍｃの両方についての特異的溶解率とのＥ対Ｔ比の比較を示すことができる。 この例では、ＣＰＧで刺激されたエフェクター細胞は、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が増加するにつれて、標的細胞をより効果的に死滅させた。 この増加は、非刺激Ｐｂｍｃでは観察されず、ＣＰＧ刺激が、標的細胞溶解の観察された増加に必要であることを示している。