父親とその四人の不妊息子におけるY染色体微小欠失

要約

Yqの微小欠失は、無精子症および重度の乏精子症と関連している。 一般に、欠失を有する男性は不妊であり、したがって、体外受精（IVF）および細胞質内精子注入（ICSI）が行われない限り、欠失は息子に伝達されない。 我々は、不妊とYq微小欠失を持つ複数のメンバーによって特徴付けられる異常な家族を報告します。 完全な生殖履歴、精液分析および血液サンプルは、関連する家族から引き出された。 ＤＮＡの調製および定量は市販のキットを用いて行った。 配列タグ付けされたサイトベースのプライマーセットY微小欠失領域遺伝子座に特異的な27対の合計は、スクリーニングのために使用されました。 無精子症（ＤＡＺ）およびリボソーム結合モチーフ（ｒｂｍ）ｃｄｎａの欠失を用いたサザンブロットを確認のために解析した。 発端者、彼の三人の兄弟と父親はすべてDAZのために削除されたが、RBMでは削除されなかったことが判明しました。 分析の時点では、発端者の父親は無精子であったが、彼の四人の息子は重度の乏精子または無精子であった。 彼らの父親とは異なり、四人の息子は不妊であり、不妊のためのIVF/ICSI治療の後にのみ娘を達成したそのうちの一人を除いて、子孫はありません。 ＤＡＺ遺伝子を含むＹ Ｑの微小欠失は、明らかに正常な繁殖力を含み得る可変表現型発現と関連している。

はじめに

不妊症はカップルの約14％で発生し（Mosher、1985）、男性パートナーの異常は症例の半分までに存在すると推定されている（Swerdloff et al., 1985). 無精子症の原因を評価するための努力は、伝統的に認識可能な原因（すなわち、異常な核型、閉塞、精索静脈瘤、ホルモン欠損など）を除外した後であることほとんどの症例（５ ０〜７ ５％）は原因不明であり、特発性と呼ばれる（Ｐｒｙｏｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997). 最近、「特発性」無精子症を有する男性の最大３ ０％が、Ｙ染色体の微小欠失を有することが報告されている（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，１ ９ ９ ３；Ｍａら． １ ９ ９ ３；Ｎａｇａｆｕｃｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，１ ９ ９ ３；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ４；Ｎａｊｍａｂａｄｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｒｅｉｊｏ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｖｏｇｔ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｐｒｙｏｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997). 正確にどのようにして、これらの微小欠失がazoo/oligozoospermiaを引き起こすかどうかは、激しい調査と議論の両方の対象です。

Y微小欠失が不妊を引き起こすという議論に不可欠なのは、肥沃な男性がY微小欠失をほとんど発現しないという観察である。 研究された２ ０ ０人の肥沃な男性のうち４人の微小欠失が報告されている（Ｐｒｙｏｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997). しかし、これらの男性の欠失は非常に小さく、最も可能性の高い些細な多型を表していました。 男性の不妊と関連付けられる種類の比較的大きい欠失は正常な豊饒の人で報告されませんでした。 一般に、これらの欠失が新規に生じ、Ｙ染色体の微小欠失の父から息子への伝達が予想されないと仮定されるが、Ｙ染色体の微小欠失の父から息子への伝達のいくつかのまれな例が報告されている(Kobayashi et al. ら、１ ９ ９ ４；Ｓｔｕｐｐｉａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｖｏｇｔ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｐｒｙｏｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997). しかし、父から一人の息子への欠失中無精子症（DAZ）遺伝子座を含む微小欠失の垂直伝達は、わずか三例で報告されている（Kobayashi et al. ら、１ ９ ９ ４；Ｖｏｇｔ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｐｒｙｏｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997). 我々は今、無精子父親と彼の四つの不妊の息子は、すべてのDAZ遺伝子座を含む明らかに同一の微小欠失を共有する四世代の家族について説明します。 この家族は、複数の子孫へのDAZ欠失の自発的な垂直伝達の最初で唯一の報告を表しています。 これは、単一のYq微小欠失が異なる個体において様々な表現型の発現をもたらすことができるという証拠を提供する。 微小欠失の存在が不妊の絶対的なマーカーではなく、明らかに正常な不妊と関連し得るという点で、臨床的に重要である。

材料と方法

Yq微小欠失のスクリーニングは、コロンビア大学のInstitutional Review Board of College of Physicians&Surgeonsによってレビューされ、承認されたプロトコルを使用して、男性不妊症のルーチンベースで行われた。 インフォームドコンセント後に患者からサンプルを採取した。

精液分析

結果は、ニコン位相差顕微鏡を用いてWHO基準を用いて分析した。＜１ ７ ４ ４＞＜５ ９ ４ ７＞血清ホルモン濃度＜４ １ ０ ３＞＜８ ０ ０ ４＞卵胞刺激ホルモン（ＦＳ Ｈ）、黄体形成ホルモン（Ｌ Ｈ）、及びテストステロンを、固相２部位化学発光酵素免疫測定法（Ｉｍｍｕｌｉｔｅ；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ） 男性の正常範囲は、ＦＳ Ｈ＜２ １ ８ ９＞１ ０ｍＩＵ／ｍｌ；Ｌ Ｈ＜２ １ ８ ９＞１ ０ｍＩＵ／ｍｌ；およびテストステロン２ ７ ０〜１ ０ ７ ０ｎｇ／ｄｌである。

ゲノムDNA

全血からのゲノムDNAの抽出は、赤血球の溶解、続いて白血球およびそれらの核の溶解によって行われた。 塩沈殿により細胞蛋白質を除去し、ｐｕｒｅｇｅｎｅ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いてイソプロパノールを用いてゲノムＤＮＡを沈殿させた。 ミネアポリス、MN、米国;カタログno。 D-5004）。＜１ ７ ４ ４＞＜５ ９ ４ ７＞ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）＜４ １ ０ ３＞＜８ ０ ０ ４＞プライマーを、乾燥オリゴヌクレオチドとして、自動ＤＮＡ合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、フォスター市、カリフォルニア州、米国）。 合計２ ７個のＹ染色体特異的配列タグ付き部位（ＳＴＳ）（図１）を、ＳＴＳマップから選択した（Ｖｏｌｌｒａｔｈ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1992). それらには、提案された３つの精子形成遺伝子座Ａｚｆａ、Ａｚｆｂ、およびＡｚｆｃが含まれる（Ｖｏｇｔ ｅ ｔ ａ ｌ． 1996年、Yq間隔5、6および7にまたがる。 迅速なスクリーニングプロトコルとして、二から六の異なるプライマー対からなるPCR多重化システムは、六つの多重化反応の合計で使用されました（表I）。 各ＰＣＲを実行すると、女性対照および正常な男性対照が含まれた。 全てのＰＣＲ反応を、ｍｊ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（登録商標）マシン中のポリカーボネート（Ｔｅｃｈｎｅ（登録商標））プレート中で実行した。 ＰＣＲ条件は本質的に以前に記載した通りであった（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1993). ２ｍｍｏｌ／ｌの各ｄＮＴＰ、５％ＤＭＳＯ、Ｍｇ２＋を含まない１×Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液）、１． 完全な混合物を、９ ４℃に予熱されたサーモサイクラーに直接置いた。: 94°C、30s（溶けること）;55°C、45s（アニーリング）;および72°c、60s（延長）。 最終延長時間は5分であった。 次いで、ＰＣＲ反応産物を、ＴＢＥ緩衝液中での電気泳動によって、３％アガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｕｌｔｒａ−ｐｕｒｅ ｇｒａｄ）上で分離した。 ＰＣＲ産物を臭化エチジウムで染色し，紫外光に曝露することにより可視化した。 多重反応において増幅を示さないＳＴＳは、適切な陽性および陰性対照を用いた単一反応ＰＣＲによって確認された。 ＳＴＳは三つの増幅障害の後に存在しないと考えられた。

Southern hybridization

Southern blottingは確立されたプロトコルに従って行われた(Sambrook et al., 1989). 手短に言えば、5μ gのゲノムDNAをHindIIIまたはTaqIで消化し、標準TBE緩衝液中の0.7％アガロースゲル上で実行し、ナイロン膜に移し、32P標識プローブとハイブリダイズした。 ＤＡＺプローブは、完全長ｃＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＤＰ１ ５ ７ ７）の精製挿入物であった（Ｒｅｉｊｏ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1995). 同様に、ＲＢＭプローブは、ＲＢＭ ｃＤＮＡクローン（ＭＫ５）のプラスミド挿入物であった（Ｍａ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1993).

父性決定

四人の息子すべての父性は、四つの高度に多型常染色体マーカーの予想される分離を示すことによって確認された(Weber And May,1989)。 これらは、それぞれ0.83、0.86、0.84および0.90のヘテロ接合性を有するD21S156、D21S270、D13S132、およびD13S159であった。

蛍光in-situハイブリダイゼーション（FISH）

FISHをCosmid63C9で行った（Saxena et al. ら、１ ９ ９ ６）、確立された方法を使用して（Ｙｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1996).

結果

発端者（図2の個人III8）とその配偶者（III-9）は、コロンビア-長老派医療センターの生殖内分泌-不妊クリニックに3年間、原発性不妊症を訴えた。 検査では正常な核型と正常な血清ホルモンレベルが認められたが、精液分析では重度の乏精子症が認められた（表II）。 STSベースのPCRによる微小欠失スクリーニングは、Y染色体長腕のサブinterval6D–6Fにおける微小欠失の存在を明らかにした（図1）。 議論の間、発端者は、彼の2人の兄（III-4とIII-6）が無精子性で不妊であることが知られていたことを報告しました。 その後の研究では、3人の兄弟全員が明らかに同一の微小欠失を持っていることが明らかになった。 そのうちの一つ（III-6）で行われた精巣生検は、”セルトリ細胞のみ”症候群を示した。

3人の不妊兄弟の微小欠失の発見は、父親が同じ欠失を持っている可能性が高いことを示唆した。 ドミニカ共和国の小さな町に住んでいた家族の残りの部分について詳細な研究が行われました。 成人家族から完全な生殖歴が引き出された。 家系図（図2）に示されている家族関係は、関連する家族（I-1、I-2、II-1、II-8およびII-1、II-2、III-1、III-4、III-6、III-8、III-10）について、いくつかの常染色体多型マーカー（データは示されていない）の予想される分離を示すことによって確認された。 非父性の証拠はなかった。 関連する家族（I-1、II-1、II-6、II-8、II-10、III-1、III-4、III-6、III-8、III-14、III-15、III-17、III-19、およびIV-1）に関する徹底的な細胞遺伝学的研究は、正常な核型を明らかにした。 精液の分析は16人の男性の七つで行われ、血液サンプルは家族のほとんどから得られました。

表IIは、関連する家族に関する精液分析および内分泌ワークアップの結果をまとめたものである。 発端者（III-8）、彼の父（II-1）と彼の三人の兄弟（III-4、III-6）の二人は、無精子性または重度の無精子性であることが判明した。 のproband最古の兄弟(III-1）減少した精液を解析する さらに、発端者の叔父（II-8）は、低テストステロンと無精子症と上昇したFSHを持っていることが判明しました。 図1に示すように、発端者、彼の父および三人の兄弟はすべて、STS PCR分析によってYqの微小欠失を有することが判明した。 DAZ(図3)およびRBM(データは示されていない)プローブを用いたサザンブロッティングは、欠失がDAZ遺伝子座を含むが、RNA結合モチーフ(RBM)遺伝子座を含まないことを確認した。 ＤＡＺ Ｃｏｓｍｉｄ６ ３Ｃ９によるＦＩＳＨ分析（Ｓａｘｅｎａ ｅ ｔ ａ ｌ．,1996)発端者の父親の(II-1)白血球のdaz遺伝子座の均一な欠如を示した(図4).

血統の個々のII-8は無精子性であったが、微小欠失を持っていなかったという発見は驚きであった。 この個体におけるＤＡＺ遺伝子座を、ＤＡＺ ｃＤＮＡおよび異なる制限酵素（Ｔａｑｉ）を用いたＳｏｕｔｈｅｒｎ分析によってさらに試験した。 ＤＡＺ遺伝子座の異常を示さなかった。 加えて、ＤＡＺ Ｃｏｓｍｉｄ６ ３Ｃ９を有する魚は、正常な強度を示した（データは示さない）。

発端者(III-8)と彼の兄(III-6)は不妊治療を求めていた。 広範なカウンセリングの後、彼らは体外受精（IVF）と細胞質内精子注入（ICSI）を選択しました。 発端者（III-8）と彼の妻（III-9）は、貧しい卵巣反応に二次的な妊娠を生成するために失敗した二つのIVF-ICSIサイクルを受けました。 発端者の兄弟（III-6）と彼の妻（III-7）は、制御された卵巣過剰刺激の一つのサイクルを受け、九卵母細胞を取得しました。 回収日に三つの射精で十一の成熟精子を発見し，ＩＣＳＩに使用した。 三つの卵母細胞が受精し、その後切断され、移植された。 彼女は健康な女性の赤ちゃん（IV-2）を出産しました。

ディスカッション

我々は、無精子の父親と彼の四不妊の息子がDAZ遺伝子座を含む明らかに同一のYq微小欠失を共有する例外的な家族を報告します。 DAZの微小欠失につながったde-novo変異は、発端者の父親（II-1）に由来しているように見えます。 この欠失は無精子症/乏精子症と男性不妊を引き起こすと予想されていますが、彼は自発的に5人の子供を妊娠させ、不妊の問題を認識していませんでした。 しかし、興味深いことに、四人の息子はすべて不妊であり、無精子性または重度の乏精子性のいずれかである。

このファミリーは、Yq微小欠失と不妊との関連に関していくつかの問題を提起している。 第一に、Yq微小欠失の垂直伝達が可能であり、男性の子孫におけるその後の不妊につながる可能性があることを確認する。 第二に、同じ欠失が異なる個体において異なる表現型をもたらす可能性があることは明らかである。 この家族の四人の男の子の父親（II-1）は分析の時点で無精子であったが、彼は25歳で最初の子供を、38歳で最後の子供を父親にした。 このように、彼は長年にわたってある程度の繁殖力を持っていました。 同様に、Y染色体、特にDAZの微小欠失は、必ずしも無精子症の生涯の歴史を意味するものではなく、大家族の形成を排除するものでもない。 一方、彼の四人の息子は不妊であり、無精子性または重度の無精子性である。

DAZ遺伝子はY染色体上の無精子症因子として提案されている。 この家族は、DAZが精子形成において重要な役割を果たすかもしれないが、それは生殖能力にとって不可欠ではないことを明らかに示している。 さらに、ＤＡＺ遺伝子クラスターの全損失は、「Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞のみ」の組織学的画像ならびに精子成熟停止と関連し得る（Ｆｏｒｅｓｔａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ７；Ｐｒｙｏｒら、１ ９ ９ ８；Ｐｒｙｏｒら、, 1997). いくつかの著者は、患者の臨床的および組織学的表現型とY微小欠失（DAZ欠失を含む）の位置との間に悪い相関を見出している（Reijo et al. ら，１ ９ ９ ５，１ ９ ９ ６；Ｖｏｇｔ ｅ ｔ ａ ｌ． ら；１ ９ ９ ６；Ｓｉｌｂｅｒら；１ ９ ９ ６；Ｓｉｌｂｅｒら。, 1998). この家族の調査結果は、そのような相関が非常に問題になる可能性があることに同意する。 発端者の兄弟（III-6）の精巣生検は、”Sertoli細胞のみ”の写真を示したが、発端者（iii-8精子数0.5×106/ml）は、生検である程度の精子成熟を有することが明らかに期待され さらに、精巣生検は、その射精成熟精子を含む個々のIII-6のように精子形成のための地理的異質性があるかもしれないので、睾丸全体の代表ではないかも

私たちは、同じ欠失を持つ家族間の表現型の違いの基礎についてのみ推測することができます。 常染色体内の同一の欠失が異なる表現型をもたらす可能性があることはよく知られている（Schinzel、1994）。 そのような違いは、それぞれの個体が自分の環境にさらされたり、様々な修飾遺伝子の発現の結果であると仮定することができます。 肥沃な父親は、彼の不妊の息子に伝達されたときに広がる微小欠失を伴って記載されている（Stuppia et al., 1996). 欠失の境界にある可変拡張は、私たちの異なる家族の間に存在する可能性がありますが、これらの分子拡張は、間隔マッピングによって区別するこ PCR解析により、同じSTSsは私たちの五人の個人で増幅することができず、DAZプローブとサザンハイブリダイゼーションは、この遺伝子クラスターの完全な欠失 観察された欠失は、実際には同一ではなく、隣接する領域には表現型発現の程度を調節する重要な遺伝子が含まれている可能性があるが、これらの結果は、このユニークなファミリーの各個体における欠失Y DNAの大きな重複（DAZ遺伝子クラスターの喪失を含む）を示している。

私たちは、発端者の叔父（II-8）が不妊と無精子症を持っているが、STS試験による明らかな微小欠失はないという事実に魅了されました。 RBMとDAZプローブの両方を用いたサザンブロット分析とDAZ cosmidを用いた魚の分析はすべて完全に正常であったため、彼は不妊の根底にある異なる病因を持っていると結論づけることを余儀なくされている。 確かに、彼は、現在の方法によっては検出できない、より小さいまたは点突然変異／摂動または近位／遠位の再配列を有し得る可能性がある。 彼は性腺毒素または精子形成に影響を与える可能性が高い他の定義可能な因子への曝露の病歴を与えなかった。

最近まで、Y微小欠失は、欠失を有する男性が一般に再現しないため、臨床的意義はほとんどありませんでした。 しかしながら、ＩＣＳＩおよび精巣精子吸引（ＴＥＳＡ）を利用して、ＩＶＦと組み合わせて、Ｙ微小欠失を有するオリゴ／無精子男性が妊娠を達成することが可能になった（Ｍｕｌｈａｌｌ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ７；Ｓｉｌｂｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ８、および個々のＩＩＩ−６）。 これは、そのような妊娠が、同様の微小欠失およびその後の不妊を有する男性の子孫を産生する可能性があるという懸念を助長している（Ｒｅｉｊｏ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ６；Ｇｉｒａｒｄｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ７；Ｋｒｅｍｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1997). 実際に、Ｙｑ微小欠失は、ＩＣＳＩを介して雄の子孫に伝達され得る（Ｋｅｎｔ−Ｆｉｒｓｔ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1996). 私たちが報告している家族は、妊娠を達成したYq微小欠失を有する男性（例えば、個々のII-1）が同じ微小欠失および不妊のリスクを息子（個人III-1、III-4、III-6、III-8）に伝達することを示唆している。 したがって、患者はICSIの前にY微小欠失スクリーニングを提供されるべきであり、彼らはYq微小欠失およびおそらく不妊を息子に送信する確実性に より多くの研究が男性不妊の遺伝的病因に焦点を当てているように、精子形成に関与する遺伝子の同定は、男性不妊の病態生理と治療を開始するた

DAZ cDNAプローブとこの原稿で彼の貴重な助けを提供するための博士David C.ペイジ;MK5（RBM1）cDNAプローブを提供するための博士クン馬; 私たちのSTS PCR方法論を検証するために使用されたYqマイクロデレット個人のDNAのためのピーター Vogt博士;そして彼らの貴重な技術支援のためのC.C.YuとパトリシアLanzano。

この研究は、コロンビア長老派医療センター臨床試験ハウススタッフ賞のオフィスによって部分的に資金提供されました。