染色体外循環DNAとは何ですか？

細胞核内のDNAは線状染色体の形でパックされていることが知られています。 長年にわたり、研究者は、円形の形で組織化された染色体と一緒にDNAのより小さな長さを観察してきました。 染色体外環状ＤＮＡ（ｅＣＣＤＮＡ）またはマイクロＤＮＡと呼ばれてきたこれらの粒子のいくつかは、典型的には小さく（＜９ ８ ９ ４＞１ｋｂ）、遺伝子疎であり、増幅されていない。 細胞中の総ＥＣＣＤＮＡ存在量は、細胞当たり数百までであり得る。 eccDNA分子はまた、無細胞形態で循環中に存在し、血液ベースのバイオマーカーとしての役割を果たす可能性を提供する。 腫瘍では、癌性細胞に排他的であるように見える別のタイプの染色体外環状ＤＮＡを検出することができる。 以前は二重分と呼ばれていましたが、現在は染色体外DNA（ecDNA）と呼ばれていますが、通常は二重項ではないため、これらのecDNA粒子はしばしば非常に大きい（平均3Mb)、細胞ごとの多くのコピーと非常に増幅され、癌遺伝子のためのマークされた強化の多くの遺伝子および調節領域を、含んでいます。 重要なことに、癌細胞において、ＥＣＤＮＡは、それらの染色体の対応物よりも転写活性であるように思われ、癌細胞に成長および生存の利点を与えることが疑われている。 現在のところ、正常細胞におけるeccDNAと癌におけるecDNAとの関係は、もしあれば理解されていない。 このような謎めいた遺伝物質であるため、eccdnaおよびecdnaについて、生物物理学的性質、産生メカニズム、生理学的役割、癌生物学における役割、診断可能性に至るまで、eccdnaおよびecdnaの側面を研究してきた専門家のパネルに疑問を提起した。

eccdnaは何をしますか？ これまでのところ、eccDNAについてあなたにとって最大の驚きは何でしたか？

Anton Hensson:ecDNAは癌における原発癌遺伝子増幅のための媒体である。 これはしばらくの間知られています。 驚くべきことは、癌におけるecDNAの頻度と、異なる染色体の部分を含む非常に複雑な構造を形成するecDNAの能力、ならびにゲノムに再挿入する能力である。

Paul Mischel:私の研究分野である癌におけるecDNAに焦点を当てたいと思います。 私にとって最大の驚きは、ecDNAがヒト癌において果たす重要な役割です。 我々のデータは、ecDNAは、少なくとも三つのインターレースメカニズムを介して癌の最も悪性形態のいくつかの積極的な行動を駆動する上で重要な役割を果た: 1)ecdnaに動原体がないので、腫瘍内遺伝の異質性を維持している間腫瘍が非常に高い癌遺伝子のコピー数を達成することを可能にする非メンデル（すなわち、非染色体）遺伝の対象となる;2)遺伝のこのメカニズムによって生成される腫瘍内遺伝の異質性は、染色体遺伝によって説明することができない速度でゲノムを変更するいくつかの癌のための顕著な能力を占め、治療を含む変化する条件に応答して急速に進化することを可能にする。; 3)非メンデル遺伝と選択によって達成された高いDNAテンプレートレベルは、我々が実証した円形アーキテクチャによって生成された変更されたクロマチン組織と相まって(博士Howard Changと密接に行われた作業で同定)、癌遺伝子の大規模な転写をもたらします。 まとめると、これらの特徴は、なぜいくつかの癌がゲノム的に爆発して変化するように見えるのか、なぜ純粋な選択的掃引を受けないのか、なぜ腫瘍内のどの細胞も、いくつかの癌タイプにおいて、その完全なスペクトルの異質性を有する腫瘍全体を要約することができるように見えるのかを説明し始める。 また、ecDNAで増幅された癌遺伝子に対する標的療法が予想されるほど成功していない理由についてのいくつかの洞察を提供します。

Anindya Dutta:核型分析によって癌に見られる長いeccDNA、二重分またはecDNAとも呼ばれ、癌を促進するために増幅される癌遺伝子を運ぶことが知られている。 最近の結果は、正常細胞および癌細胞株におけるＥＣＣＤＮＡの９ ０％を構成する、より小さなＥＣＣＤＮＡの大集団、＜９ ８ ９ ４＞１ ０ ０ ０ｂｐの長さが存在することを示唆している。 癌細胞はまた、より長いecdnaを含み、核型決定によって常に見えるとは限らず、1kbから二重分の大きさの範囲である。 完全な遺伝子を含むのに十分な長さの円は、遺伝子を過剰発現させ、それらを増幅することができる。 これは長いecdnaを含んでいる癌のために非常に重要です。 小さな円の機能は不明であるが、我々は、彼らが規制緩和された方法でRnaを発現することができ、Rnaが細胞遺伝子を抑制するためにマイクロrnaと低干渉Rnaに処理されていることを示している。

私にとって、最大の驚きは、正常な組織であってもeccDNAがどのようにユビキタスであるか、そしてそれらのほとんどが癌であっても体性的にモザイク（異なる細胞間で異なる）であるという事実の私たちのオリジナルの発見である。 癌遺伝子を運ぶeccDNAが癌で行うように、同じeccDNAが癌の多くの細胞で見られるのは、それらが細胞に選択的利点を与えるときだけである。

: 1）eccDNAは真核細胞における共通の遺伝的要素であり、2）eccDNAは真核ゲノムのすべての部分から発生する可能性があり、3）選択は、腫瘍における複雑なeccDNA上のエンハンサーおよび癌遺伝子の共増幅につながる可能性があり、4）特定の遺伝子座は、酵母（CUP1およびHXT6HXT7）において再発的かつ高率にeccDNAを形成するようである。 後者の結果は、eccDNAが環境の変化（高cupper、CUP1、および低グルコース、HXT6HXT7）に迅速に適応することによって進化に重要な役割を果たすことができることを示唆しているため、本当に興味深いものである。

デニス-ロー: 私のグループは、ヒト血漿中の環状DNA分子を探し始めたときに、最初にeccDNAに興味を持ちました。 私たちの旅は、約16kbのDNA分子の円形片としてミトコンドリアの内部に存在するミトコンドリアDNA（mtDNA）の調査から始まりました。 これらの結果は，ヒト血しょう中に環状および線状ｍｔｄｎａ分子が存在することを示した。 この研究からの驚きの1つは、環状のmtDNA分子と線状のmtDNA分子が異なる起源の組織を有することを実証することである。 したがって、環状ｍｔＤＮＡ分子は、主に造血系由来であり、一方、直鎖状ｍｔＤＮＡ分子は、主に肝臓由来である。

我々はその後、血漿中のeccDNAを探すための作業を拡張しました。 特に、本発明者らは、胎児ＥＣＣＤＮＡ分子が妊婦の血漿中で検出可能であることを実証した。 私たちのグループは、循環DNAのサイズ分布に長年にわたって興味を持ってきました。 母体血漿中のｅＣＣＤＮＡ分子（２ ０ ２ｂｐおよび３ ３ ８ｂｐに顕著なサイズピークを有する）は、線状ＤＮＡ分子（１ ６ ６ｂｐでのモーダルサイズ）よりも長いサイズ分布を有することに注目す 血漿中の線状ＤＮＡ分子に関する我々の以前の研究は、母体血漿中の線状胎児ＤＮＡ分子が母体起源の線状ＤＮＡ分子よりもわずかに短いサイズ分布を有することを示した。 我々の研究のもう一つの驚きは、母体起源のものと比較して、循環する胎児eccDNA分子の同様の短さを観察したことである。

細胞内のeccdnaの産生メカニズムに関するあなたの好ましい仮説は何ですか？ この仮説を裏付ける証拠は何ですか？

Anindya Dutta:eccDNAはDNA修復の副産物として産生されていると思います。 これの主な証拠は、それらがDNA損傷を増加させる薬剤によって増加されることであり、我々は、MSH3（ミスマッチ修復に関与する）などの特定のDNA修復遺伝子がeccDNAを産生するために必要とされることを報告している。

: 私は、任意の形態のDNA損傷が潜在的に既知のDNA修復機構を介してDNA循環化につながる可能性があるモデルを支持しています。 これには、相同組換え、マイクロホモロジー、および他のDNA修復経路と一緒に結合する非ホモ末端を介してそれらの形成が含まれる。 私たちの証拠のほとんどは、eccDNAにつながった染色体ブレークポイントの周りの相同性に基づいており、私は突然変異体の研究はまだ因果関係を確立す 再複製はまた、（Maitreya Dunhamからの）起源依存性反転反復増幅モデルで説明されているように、環状DNAを生成する可能性があるが、我々はまだこのメカニズムがいかに重要であるかを探求する必要がある。 ランダムなプロセスのほかに、いくつかの円は、レトロトランスポゾンのtranspositionalライフサイクル中に染色体外線状DNAの環状化から長い末端リピートeccDNAが生

アントン-ヘンセン: 出版された文献と私たち自身の観察に基づいて、私はeccDNAの生成に寄与する多くの異なるメカニズムがあるかもしれないと信じています。 EccDNAはchromothripsisのような破局的なゲノムの再配列プロセスによって作成することができますがまた形成に貢献するかもしれないゲノムの不安定の他のプロ

Paul Mischel:再び、私は癌のecDNAに私の応答に焦点を当てます。 EcDNA形成の歴史的見解があります,またはその時点で二重分形成と呼ばれます,何かが起こることで、そのネイティブ染色体の位置からDNAのストレッチ Robert Schimke、Geoff Wahl、Nicholas Vogt、Bernard Malfoyなどの研究者がこの知識に貢献しました。 正確な分子メカニズムは、DNA損傷および応答システムの可能性のある異常との関係は、不完全に理解されたままである。 それは私たちの研究室を含む積極的な研究の分野です。 さらに、David Pellmanらは、遅れている染色体が”立ち往生”し、小核に入れられ、効果的に切り刻まれたときに起こるchromothripsisが潜在的にecDNAを形成する可能性があることを示唆していた。 Peter LyとDon Clevelandの最近の実験研究では、染色体分解性Y染色体を設計し、染色体分解が遺伝子増幅のメカニズムとしてecDNA形成をもたらす可能性があることを示唆している。 したがって、複数のメカニズムが選択によって作用されるｅＣＤＮＡ形成をもたらす可能性があることは非常に可能である。 Ｅｃｄｎａ形成に寄与するプロセスのより深い機械論的理解を開発することが重要である。

Dennis Lo:母体血漿中のeccDNA分子を含むサイズ分布解析作業では、ヌクレオソーム署名の証拠の数を観察しました。 例えば、我々は10bpの202bpと338bpの顕著なサイズのピークの近くのサイズ分布の周期性を観察しています。 私たちの推測では、202bpのサイズは約ヌクレオソームコアプラス二つのリンカーのサイズであり、338bpのサイズは約二つのヌクレオソームコアプラス二つのリンカーのサイズであると推測されている。 もう一つの注目すべき観察は、母体血漿中で最も頻繁に観察されるeccDNA分子の中で、我々はeccDNA分子の接合部位にトリヌクレオチドモチーフの四組を観察してい このような部位では、第一および第三のモチーフは直接反復であり、第二および第四は別の直接反復のセットである。 これらの観測が、eccDNAの産生メカニズムの理解の向上に貢献することを願っています。 私たちは、完全なモデルを構築するためのすべての情報を持っていないことを完全に理解していますが、フィールド全体がそれに向かって進んでいる

eccdnaとがんについては何が知られていますか？ Eccdnaはどのようにして癌細胞の悪性特性に寄与していますか？

Paul Mischel:私たちは次のことを学びました: 1)ecdnaは癌に排他的であるように見える、または少なくとも、我々は正常な細胞でそれを見ていない、2)ecdnaは、高い癌遺伝子のコピー数を駆動し、非メンデル、非クロモソーム遺伝の彼らのメカニズムを介して腫瘍内遺伝的異質性を維持する;3)ecdnaは、この継承メカニズムのために、治療を回避することを含め、急速に彼らのゲノムを変更することができます;4)ecDNAの高いDNAテンプレートレベルは、変更されたクロマチンアーキテクチャと相まって、大規模な癌遺伝子転写を駆動し、方法でエピゲノムを改造することができますそれは腫瘍形成に貢献します。

アントン-ヘンセン: ecDNAは癌遺伝子増幅のための手段であるだけでなく、線形ゲノムへの再統合を通じてゲノムリモデリングにも貢献することができる。 我々は、環状DNAの再統合は、機能的に重要なゲノム領域の破壊につながることを示しており、この破壊は、癌細胞の多くの悪性の特徴に貢献することが

Birgitte Regenberg:我々は、eccDNA上の多くの癌遺伝子の増幅が癌と相関し、特定のeccDNA増幅を有する癌患者は予後不良であることを知っている。 ＥＣＣＤＮＡ上のｍｙｃおよびＥＧＦＲのような癌遺伝子の過剰発現は、細胞を再プログラムし、腫瘍形成状態を誘導する可能性が高い。

Anindya Dutta:癌の円は正常細胞の円よりも長く、別の名前を得ることが示唆されています：ecDNA。 我々は今、それらがほぼすべての癌に存在するが、細胞遺伝学によって二重分として検出可能であるのに十分な大きさではないことを知っている。 長いｅＣＤＮＡは、完全な遺伝子を有し、これらの遺伝子が癌遺伝子または癌ドライバー遺伝子である場合、ｅＣＤＮＡは、それらの過剰発現および増幅を可能にする。 例えば、ecdnaは次の癌遺伝子を運ぶ:MDM2癌遺伝子(最初に二重分で発見される)はP53腫瘍のサプレッサーを不活性にするが、EGFRの癌遺伝子は神経膠腫および神経膠芽細胞腫の細胞をEGFにhyper-responsiveにさせる。 Ecdnaは娘細胞間で均等に分離されていないので、娘細胞間の円のランダムな分布は、それが簡単に娘のいくつかは、円のより多くのコピーを取得し、したがって、エンコードされた癌遺伝子の多くを発現することにより、成長の利点を得ることができます。 従って、DNAの円の非メンデルの遺伝は癌細胞が癌に成長の利点を与える円を増幅することができるようにそれをもっと簡単にします。

eccdnaは、どのような方法で、どのように疾患評価のためのバイオマーカーとして役立つと思いますか？

Dennis Lo:プラズマ中のeccDNA分子は、バイオマーカー研究にとって興味深い方向になると思います。 一つの課題は、それらの全体的な濃度が血漿中の線状DNA分子の濃度よりも実質的に低いように見えることである。 血漿中のeccDNA分子のサイズ分布が大きいことは、より長い分子が起源の組織からより多くの遺伝的およびエピジェネティックな情報を潜在的に運

Anindya Dutta:我々はすでに、eccDNAが1）腫瘍および胎児から血液中に放出され、2）無細胞循環DNAのプールで検出および定量化できることを示しています。 それらは線状細胞を含まない循環DNA（平均）よりも長い（平均：250塩基）ため: 150塩基）およびより安定した循環無細胞eccdnaは、癌遺伝子の変異を検出するために（癌における）または発達的に重要な遺伝子の変異を検出するために（非侵襲的出生前検査のために）有用である可能性がある。 正常組織と比較して癌に見られる円のより長いサイズはまた、癌の液体生検におけるスクリーニングツールとして有用であり得る。

Birgitte Regenberg:はい、eccDNAは突然変異やゲノム再配列に関連する多くの疾患のバイオマーカーとして潜在的に役立つと思います。 Ｔ細胞受容体遺伝子由来のｅｃｃｄｎａは，重症複合免疫不全症の検出に既に使用されており，最近のデータにより，胎児由来のｅｃｃｄｎａが母親の血漿中で検出できることが示されている。 血漿中の他のｅｃｃｄｎａは癌のモニタリングのためのマーカーとして役立つ可能性が高いと思われるが、血漿中のｅｃｃｄｎａの濃度は制限されている可能性が高い。

Anton Henssen:小児腫瘍学において、MYCN含有二重分染色体の形のecDNAは、神経芽細胞腫を患っている患者の臨床リスク評価のための確立されたバイオマーカーです。 私は、同様に、他のecdnaは、多くの腫瘍実体における様々な疾患特性のバイオマーカーとして役立つことができると信じています。

Paul Mischel:はい、ecDNAがより攻撃的な癌タイプのバイオマーカーであり、治療への応答を含め、いくつかの癌が急速に進化する能力についての新しい洞察を提供す また、がんがecDNAによって引き起こされる患者は、異なる方法で治療する必要があるかもしれないと考える説得力のある理由もあります。

eccDNAを分析するためのあなたの好きなアプローチは何ですか、そして利点は何ですか？

Birgitte Regenberg:ほとんどのeccDNAは低コピー数で存在し、全ゲノム配列決定によって捕捉されません。 私の研究室では、高コピー eccDNAと低コピー eccDNAの両方を測定するために、eccDNA（Circle-SeqおよびCircle-Map、L.Maretty、D.Botstein、M.Mohiyuddinと共同）を単離し、配列し、組み立てる方法を開発しました。 これらの方法は、任意の特定の細胞および状態におけるゲノム全体でeccDNAをプロファイルすることを可能にする。 これにより、eccDNAが年齢や病気とどのように相関するかについての洞察を得ることができます（J.S.Johansen and Y.との共同研究 ルー）、および基本的なレベルでは、それらが形成、進化、および細胞の集団で滅びる方法を理解しています。

Anindya Dutta:私の研究室では、円の特徴である接合を特定するために、エクソヌクレアーゼ耐性円をランダムなヘキサマーでローリングサークル増幅した後、ペアエンドシーケンス(Circle-Finder)を使用しています。 ほとんどのゲノミクス実験にはローリングサークル増幅が含まれていないため、他のグループによって生成されたゲノミクスデータを再解析して円を特定することはできません。 しかし、最近、我々はシーケンシング（安価）または全ゲノムシーケンシング（はるかに高価）を使用してトランスポザーゼアクセシブルクロマチンのアッセイは、DNAの円を検出することができることを示しています。 私たちは、これらのより広く使用されている技術は、すでに既存のデータセット内の円の識別を可能にすることを期待しています。 さらに、Dennis Loらの最近の論文は、一般的な切断制限酵素による消化と接合の断片の配列決定によって円を検出できることを示しています。

デニス-ロー: 我々はまず、サンプル中の線状DNA分子の多くを除去するエキソヌクレアーゼで血漿DNAを処理する。 次に、制限酵素またはトランスポザーゼのいずれかを使用して円を切断し、さらなる分析（例えば、ＤＮＡ配列決定）のための線状ＤＮＡ分子を形成する。 トランスポザーゼベース法は，ｅｃｃｄｎａ分子内に制限酵素認識部位の存在を必要とする制限酵素ベースのアプローチとは異なり，トランスポザーゼ法は任意のｅｃｃｄｎａ分子に潜在的に作用できるという利点を有すると考えた。

ポール-ミスシェル: 私の同僚Vineet Bafnaは、ecDNA構造を分析するためのAmplicon ArchitectとAmplicon Reconstructorを含む強力なツールキットを開発しました。 実際には、博士Bafnaと博士Verhaakとの進行中の作業は、より良い公に利用可能な全ゲノムシーケンスデータベースでecDNAを分析するために行われています。 また、同僚のDrs.Howard ChangとBing Renと緊密に協力して、「エピジェネティック」ツールキットの側面を使用して、癌のecDNAを特徴付けることに取り組んでいます。

アントン-ヘンセン: 私たちは、ecdnaの構造を正確にマッピングする機会を提供する長期読み取りシーケンシングでecDNAを特異的に分離し、配列するのが好きです。

あなたが最も探求したいeccDNAに関連する研究の質問は何ですか？

Paul Mischel:私たちは、ecDNAに関連する多くの重要な問題を理解することに非常に興味があります。 第一に、ecDNAはどのように形成され、その形成に関与する重要な分子”プレーヤー”は何ですか？ 第二に、ecDNAの維持と機能に関与する分子メカニズムは何ですか？ さまざまなコンポーネントが使用されていますか？ 同じコンポーネントの使用方法は異なっていますか？ 第三に、患者にとっての臨床的意味は何ですか？ EcDNAを使用して、臨床経過について重要なことを教えてもらえますか？ 第四に、癌がecDNAによって駆動される患者を助ける新しい治療法を開発するために使用できる介入のポイントを見つけることができますか？

Anton Henssen:医師の科学者として、私はecDNAに関する我々の理解を利用して、ecDNA主導の癌に罹患している患者のための新しい診断および治療アプローチを見つ

デニス-ロー: 私は、妊娠関連障害（例えば、子癇前症）を検出または監視するための母体血漿中のeccDNAの能力を探求したいと思います。 私はまた、eccDNA分析のためのより新しい、潜在的により包括的なアプローチの開発に興味があります。 私は、現在利用可能な方法論は、循環eccDNA分子の選択されたサブセットに一定のバイアスを持っている可能性があることを認識しています。

Anindya Dutta:正常細胞に存在するeccDNAの機能を見つけたい。 それらは非常に遍在的で身体的にモザイクであるため、正常組織における細胞間の異質性に寄与したり、何らかの形態の病理に寄与したりすると、非常にエキサイティングになるでしょう。 私はまた、癌におけるこれらの経路を妨害することが、遺伝子増幅の潜在的な遺伝子座の明確な癌を助け、したがって治療に役立つことを期待して、正常細胞および癌細胞における円の形成にどのような経路が関与しているかを描写したいと考えています。 最後に、私は癌の液体生検および胎児の遺伝病の非侵襲的な出生前検査におけるeccDNA配列決定の採用を見たいと思います。

Birgitte Regenberg:eccDNAが真核生物のゲノムの遺伝的変異と進化にどのように貢献するかを理解するだけでなく、eccdnaがゲノム内でどのように形成され、維持されているかを理解することを熱望している。 四つの要因は、細胞系列における環状DNAのターンオーバーを決定する可能性があります: それはその染色体遺伝子座、複製する能力、分離のモードだけでなく、それはそのホスティング細胞に提供する成長の利点または欠点から形成される速度。 さらに、真核細胞は、ＥＣＣＤＮＡを分解または分泌する機構を潜在的に有することができる。 これは、生殖系列のeccDNAが次の世代に大きな負の影響を及ぼす可能性があるため、多細胞生物の減数分裂細胞にとって特に重要です。 酵母からの最近のデータは、減数分裂細胞が実際にeccDNAのサブセットを隔離するメカニズムを進化させたことを示唆している（バークリーのÜnalの研究室から）、

著者の貢献

すべての著者は、この論文の知的内容に貢献しており、以下の4つの要件を満たしていることを確認しました。(a)データの概念と設計、取得、またはデータの分析と解釈に多大な貢献をしています; (b)知的コンテンツのための記事の起草または改訂、(c)公開された記事の最終的な承認、および(d)記事のすべての側面について責任を負うことに合意し、記事の任意の部分の正確性または完全性に関連する質問が適切に調査され、解決されることを保証する。

著者の開示または利益相反の可能性

原稿の提出時に、すべての著者が著者開示フォームに記入しました。 開示および/または潜在的な利益相反:

雇用またはリーダーシップ

R.W.K. Chiu,Clinical Chemistry,AACC;Y.M.D.Lo,Clinical Chemistry,AACC,DRA Limited,Take2Holdings.

コンサルタントまたはアドバイザリーの役割

R.W.K.Chiu,Grail;Y.M.D.Lo,Grail,Decheng Capital;P.Mischel,Boundless Bio,Inc.

株式保有

R.W.K.Chiu,Grail,DRA Limited,Take2Holdings;Y.M.D.Lo,Grail,DRA Limited,Take2Holdings;P.Mischel,Boundless Bio,Inc.

Honoraria

なし宣言しました。

研究資金

R.W.K.Chiu,Grail;A.Dutta,National Institutes of Health;Y.M.D. Lo,Grail,Hong Kong Research Grants Councilテーマベースの研究スキームT12-403/15NおよびT12-401/16W.

専門家の証言

いずれも宣言されていません。

Patents

R.W.K.Chiu,PCT/CN2020/081066;A.Dutta,USA PPA62832443;Y.M.D.Lo,multiple patents and patent applications in diagnostic applications of cell-free DNA;P.Mischel,SD-2019-149-1、SD-2019-149-2、SD-2019-149-3…..

その他の報酬

A.Dutta,Gordon Research Conference,Cold Spring Harbor Lab,BIH Academy,Shenzhen Medical School.

非標準略語

• eccDNA

  染色体外環状DNA

• ecDNA

  染色体外DNA

• mtDNA

  ミトコンドリアDNA