循環腫瘍DNA

分析前の考慮事項edit

血液をEDTAチューブに集めて保存すると、白血球はctdnaが存在する量よりも多くの倍高い量でゲノム野生型DNAを溶解し、試料に放出し始める。 これは突然変異か他のctDNAのバイオマーカーの検出をより困難にします。 市販の細胞安定化チューブの使用は、白色細胞の溶解を防止または遅延させ、それによってｃｔＤＮＡの希釈効果を減少させることができる。 Sherwoodらは、EDTA K3とStreck BCTチューブの両方で収集された一致したサンプルにおけるKRAS変異の優れた検出を示した。 細胞安定管の利点は血が血しょうにすぐに処理することができない状態で実現することができる。

他の手順では、野生型DNAを”汚染する”量を減らし、ctDNAの検出をより実現可能にすることもできます:

• ctDNA分析のために血漿を抽出する前に血液サンプルを凍結しないでください
• 2-4時間以内に血漿にサンプルを処理します（EDTAチューブに採取した場合）
• ヘパリン化管を使用しないで、ヘパリンはDNAのヘリカル構造を模倣することによりPCRを阻害します
• 二重遠心分離ステップを実行します（血液を遠心分離して血漿を除去し、血漿上で繰り返しますDna抽出の前に、より多くの細胞破片を除去するために）。
• 血漿は、ctDNA回収のための血清よりも優れています

ctdnaの抽出edit

ctDNA分析の主な魅力は、血液採取を通じて非侵襲的に抽出されることです。 ＣｆＤＮＡまたはｃｔＤＮＡの取得には、典型的には、ＥＤＴＡ被覆管への約３ｍｌの血液の収集が必要である。 EDTAの使用は、血液の凝固を減少させるために重要である。 血液の血漿分画および血清分画は、遠心分離ステップによって分離することができる。 続いて、これらの画分からｃｔＤＮＡまたはｃｆＤＮＡを抽出することができる。 血清はより高いレベルのcfDNAを有する傾向があるが、これは主にリンパ球由来のDNAに起因する。 高レベルの汚染cfDNAは、ctDNA検出の感度を低下させる可能性があるため、最適ではありません。 したがって、研究の大部分は、ｃｔＤＮＡ単離のために血漿を使用する。 次いで、血漿を再び遠心分離によって処理して、残留した無傷の血液細胞を除去する。 上清は、市販のキットを使用して行うことができるＤＮＡ抽出のために使用される。

ctdnaの解析edit

抽出後のctDNAの解析には、様々な増幅および配列決定法の使用が必要です。 これらの方法は、目標が標的化されていないアプローチですべての遺伝子を尋問することであるか、または目標が標的化されたアプローチで特定の遺伝子

Untargeted approachesEdit

全ゲノムまたは全エクソームシーケンシングのアプローチは、疾患負荷を監視したり、薬剤耐性を追跡しながら、腫瘍DNAの新しい変異を発見する 標的化されていないアプローチは、腫瘍の異質性を観察したり、新しい薬物標的を発見するための研究にも有用である。 ただし、特定のアプリケーションではターゲット設定されていない方法が必要になる場合がありますが、より高価で解像度が低くなります。 これは、まれな突然変異を検出することを困難にするか、または低いｃｔＤＮＡレベルが存在する状況（最小残存疾患など）で検出することを困難にする。 さらに、全ゲノムアプローチを用いて、腫瘍細胞からのDNAと正常細胞からのDNAとを区別することに問題があり得る。

全ゲノムまたはエクソーム配列決定は、通常、高スループットDNA配列決定技術を使用します。 代わりに、エクソーム全体のみに配列決定を制限することは、費用を減少させ、速度を増加させることができるが、DNAの非コード調節領域における変異に関する情報を失うことを犠牲にすることができる。 配列決定によってDNAの多型を単に見ることが腫瘍または正常な細胞からDNAを区別しない間、この問題は正常なDNAの対照サンプルと比較することに）重要なことは、全ゲノムおよび全エクソームシーケンシングは、最初の変異発見に有用である。 これはより敏感な目標とされた技術の使用に情報を提供し、病気の監視の為にそれから使用することができる。

全ゲノムシークエンシングは、cfDNAの構造特性、断片のサイズ、およびそれらの断片化パターンを回復することを可能にする。 これらのユニークなパターンは、ｃｔＤＮＡの検出を改善するか、またはこれらの断片の起源の組織を局在化するための重要な情報源となり得る。 サイズ-in vitroまたはin silico法による短い断片（<150bp）の選択は、突然変異およびコピー数の異常の回復を改善することができる。

Digital KaryotypingEdit

この方法は、もともとジョンズ-ホプキンス大学のBert Vogelstein、Luis Diaz、Victor Velculescuの研究室によって開発されました。 染色体を可視化するために染色体バンドを染色するために染料が使用される通常の核型検査とは異なり、デジタル核型検査では、コピー数の変動を計算するためにゲノム全体の遺伝子座のDNA配列を使用します。 コピー数の変化は癌で共通で、遺伝子のヘテロ接合性の損失がより低い表現による減らされた機能の原因となるかもしれない状態を記述するか、ま

再配置された末端のパーソナライズされた分析（PARE）編集

イルミナHiSeqなどの高スループット配列決定法を用いて全ゲノムを配列決定した後、PAREをデータに適用して染色体の再配列および転座を分析する。 この技術は、もともと固形腫瘍DNAを分析するために設計されたが、ctDNAアプリケーションのために変更されました。

DNAメチル化とヒドロキシメチル化Edit

適切なエピジェネティックマーキングは、正常な遺伝子発現と細胞機能にとって不可欠であり、エピジェネティックパターンの異常な変化は癌の特徴である。 通常のエピジェネティックな状態は、DNAメチル化によって少なくとも部分的に細胞内で維持される。 CtDNAにおける異常なメチル化パターンを測定することは、「CpGアイランド」と呼ばれるDNA領域の安定したメチル化のために可能である。 重亜硫酸塩処理によりｃｔＤＮＡのメチル化を検出することができる。 重亜硫酸塩処理は、メチル化されていないシトシンを化学的にウラシルに変換し、メチル化されたシトシンを未修飾のままにする。 DNAはその後配列決定され、DNAメチル化パターンへの任意の変化を同定することができる。 DNAのヒドロキシメチル化は癌を含むcfDNAの病気にかかった条件対健康の予言的なマーカーであるために示されていた同様に関連付けられた印である。 CtDNAにおける異常なヒドロキシメチル化パターンの測定は、シカゴ大学（Chuan He lab、）スタンフォード大学（Quake lab、）およびケンブリッジEpigenetix社の研究者によって証明されている。

標的型アプローチ編集

標的型アプローチでは、ctDNAの配列決定は、関心のある癌の変異ホットスポットに基づいて構築された遺伝的パネルに向け これは、変異がdruggableターゲットで同定されている状況での治療を知らせるために特に重要です。 液体生検と標準的な一次組織生検を組み合わせることにより、各患者にctDNAの標的分析をパーソナライズすることも可能です。 原発腫瘍生検の全ゲノムまたは全エキソーム配列決定は、患者の腫瘍に特異的な遺伝的変異の発見を可能にし、患者のctDNAのその後の標的配列決定に使 CtDNAの検出の最も高い感受性は特定の一塩基多型(Snp)の目標とされた配列決定によって達成されます。 一般的にホットスポット変異を有する癌遺伝子などの一般的に変異した遺伝子は、標的配列決定アプローチのための良好な候補である。 逆に、ほとんどの腫瘍抑制遺伝子は、遺伝子全体にわたって広範囲の機能変異の可能性のある喪失を有し、そのため、標的配列決定には適していない。

標的化アプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはデジタルPCRを介してctDNAを増幅する利点がある。 これは、血流中を循環するDNAのレベルが比較的低いだけでなく、ctdnaが抽出された全無細胞DNAの割合が小さいため、ctDNAを分析する際に特に重要です。 したがって、関心領域の増幅は、ｃｔＤＮＡ検出の感度を劇的に改善することができる。 しかし、PCRを介した増幅は、DNAポリメラーゼの固有の誤り率を考えるとエラーを導入することができます。 配列決定中に導入されたエラーはまた、ctDNA変異の検出感度を低下させる可能性がある。

Droplet Digital PCR(ddPCR)Edit

この方法は、もともとJohns Hopkins大学のBert Vogelsteinのグループによって命名されたdigital PCRに由来しています。 液滴デジタルPCRは、油/水エマルジョンを使用して液滴にDNAの単一の部分を分割するために液滴発生器を利用しています。 その後、個々のポリメラーゼ連鎖反応は、ctDNAの領域に対して選択されたプライマーを使用して各液滴で発生し、エンドポイントに進行する。 目的の配列の存在は、増幅された領域に結合する蛍光プローブによって測定される。 ddPCRはctDNAの対立遺伝子および突然変異体の頻度の非常に量的な査定を可能にするが、1つの試金（5まで）で使用することができる蛍光調査の数によって 試金の感受性は分析されるDNAの量によって変わることができ、10,000に付きおよそ1です。

ビーズ、乳化、増幅、磁気学（ビーム）編集

この技術は、フローサイトメトリーを使用してctDNAの変異を同定するために、液滴デジタルPCRに基づいて構築されています。 血液からｃｔＤＮＡを抽出した後、関心領域を標的とするように設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行う。 これらのプライマーはまた特定のDNA配列、か札を含んでいます。 増幅されたDNAはstreptavidin上塗を施してある磁気ビードと混合され、しぶきに乳状になります。 タグに結合するように設計されたビオチニル化プライマーは、DNAを増幅するために使用される。 ビオチン化は、増幅されたDNAがストレプトアビジンで被覆された磁気ビーズに結合することを可能にする。 ＰＣＲが完了した後、ｄｎａ結合ビーズを磁石を用いて分離する。 その後、ビーズ上のDNAを変性させ、各DNAテンプレートに特異的な蛍光オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。 得られたビーズ-DNA複合体は、その後、フローサイトメトリーを用いて分析される。 この技術は、ＤＤＰＣＲとの結合に起因する対立遺伝子および突然変異頻度を捕捉することができる。 しかし、ddPCRとは異なり、蛍光結合プローブを使用する柔軟性のために、より多くのDNA配列を尋問することができる。 このシステムの別の利点は、単離されたＤＮＡが下流の配列決定にも使用され得ることである。 感度は1.6in104から4.3in105です。

cancer Personalized Profiling by deep Sequencing(CAPP-Seq)Edit

この方法は、もともとスタンフォード大学のAsh AlizadehとMaximilian Diehnのグループによって記述されました。 この技術はctdnaの検出に関連したDNAの配列を目標とするのにビオチン化されたオリゴヌクレオチドセレクタープローブを使用します。 公的に利用可能な癌データベースを使用して、再発指数を計算することにより、癌における再発変異に対するプローブのライブラリを構築した。 このプロトコルは、ｃｔＤＮＡ収集で観察された低ＤＮＡレベルに対して最適化された。 その後、単離されたDNAは、感度を高めるために深い配列決定を受ける。 この技術は何百ものDNAの領域の質問を可能にする。 CAPP-SeqのctDNA検出感度は2.5分子で1,000,000であることが報告されている。

Tagged AMplicon deep Sequencing(TAM-Seq)Edit

TAM-Seqは、ctDNAの変異を検出するために遺伝子全体の標的配列を可能にします。 最初に一般的な増幅ステップは150-200bpセクションの目的の遺伝子全体に及ぶプライマーを使用して行われます。 次に、マイクロ流体システムを使用して、各アンプリコンに固有の識別子を有するアダプターを取り付け、DNAを並列の単鎖反応でさらに増幅する。 この技術は、進行卵巣癌患者におけるTP53腫瘍抑制遺伝子に散在する突然変異を正常に同定することが示された。 この手法の感度は50分の1です。

Safe-Sequencing(Safe-Seq)Edit

この方法は、もともとJohns Hopkins大学のBert Vogelsteinと彼のグループによって記述されました。 Safe-Seqは、希少変異体に対する感受性を高めるために、超並列配列決定の誤り率を低下させる。 これは、各ＤＮＡ鋳型に固有識別子（ＵＩＤ）配列を付加することによってこれを達成する。 その後、追加されたUidを使用してDNAを増幅し、配列決定する。 同じUIDを持つすべてのDNA分子（UIDファミリー）は、1つの分子から増幅されたため、同じ報告されたDNA配列を持つ必要があります。 しかし、突然変異は増幅を介して導入することができ、または配列決定および分析ステップで誤った塩基割り当てが呼び出されることがある。 ＵＩＤの存在は、これらの方法論の誤りをｃｔＤＮＡの真の突然変異から分離することを可能にする。 配列決定されたリードの95％が一致している場合、突然変異は”超変異体”とみなされます。 このアプローチの感度は100万人に9人です。

Duplex sequencingEdit

このメソッドは、Safe-Seqテクニックで追加された単一のUidの改善です。 二重鎖配列では、ランダム化された二本鎖DNAはユニークなタグとして機能し、不変のスペーサーに接続されています。 タグは、ＤＮＡ断片（αタグおよびβタグ）の両端に結合され、その結果、ＰＣＲ−一方の鎖が５’末端にαタグおよび３’末端にβタグを有し、他方の鎖が５’末端にβタグお これらのDNA断片は、その後、タグの不変配列に対してプライマーで増幅される。 増幅されたDNAは配列決定され、分析される。 二本鎖アダプターを有するDNAを比較し、両方の鎖の間にコンセンサスがある場合にのみ変異が受け入れられる。 この方法は、配列決定からのエラーと初期段階のPCR増幅からのエラーの両方を考慮に入れます。 変異体を発見するアプローチの感度は1in10^7です。

統合されたデジタルエラー抑制（ide）-強化されたCAPP-SeqEdit

ideは、エラーを減少させ、したがって検出感度を高めるために、ctDNAのCAPP-Seq解析を改善します。 2016年に報告されたIDEは、capp-Seqとduplex barcoding sequencing技術、およびCAPP-Seqハイブリダイゼーションステップに関連するステレオタイプのエラーを除去する計算アルゴリズムを組み合わせています。 本方法はまた、可能であれば二重鎖配列決定を統合し、無細胞ＤＮＡからのより効率的な二重鎖回収のための方法を含む。 この改良版のCAPP-Seqの感度は10万部で4です。