細菌株と培地
C.acetobutylicum ATCC824を、窒素97%と水素3%の雰囲気を含む嫌気性チャンバー(Coy Laboratory Products)内で培養した。 ２ＸＹＴＧ ｍｅｄｉｕｍ６ ７は、１ ６ｇ／Ｌのトリプトン、１ ０ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａｃｌ、および１ ０ｇ／Ｌのグルコース（特に断りのない限り）を含有し、ｐＨを５に調整した。液体媒体のための2、および固体媒体のための5.8（また15g/L寒天を含んでいます）。 クロストリジウム成長培地（CGM）68は、30g/Lグルコース（特に断りのない限り）、6.25g/L酵母抽出物、2.5g/L硫酸アンモニウム、1.25g/L NaCl、2.5g/Lアスパラギン、0.95g/L一塩基性リン酸カリウム、0.95g/L二塩基性リン酸カリウム、0.5g/L硫酸マグネシウム七水和物、13mg/L硫酸マンガン七水和物、および13mg/L硫酸鉄を含んでいた。PHを6.4に調整した七水和物。 P2medium69には、80g/Lのグルコース（特に断りのない限り）、1g/Lの酵母抽出物、2.2g/Lの酢酸アンモニウム、0が含まれていた。5g/Lリン酸カリウム一塩基性、0.5g/L硫酸カリウム二塩基性、0.2g/L硫酸マグネシウム七水和物、1mg/Lパラアミノ安息香酸、1mg/Lチアミン塩酸塩、10μ g/Lビオチン、10mg/L硫酸マンガン七水和物、10mg/L硫酸第一鉄七水和物、および10mg/L NaClをpH6.4に調整した。 クロストリジウム基礎培地（CBM）70は、10g/Lのグルコース、0.5g/Lの一塩基性リン酸カリウム、0.5g/Lの二塩基性リン酸カリウム、4g/Lのトリプトン、0を含2g/L硫酸マグネシウム七水和物、10mg/L硫酸マンガン七水和物、10mg/L硫酸第一鉄七水和物、1mg/Lパラアミノ安息香酸、1mg/Lチアミン塩酸塩、2μ g/Lビオチン、pHを6.9に調整した。 固体ＣＧＭプレートについては、１ ５ｇ／Ｌの寒天を添加した。 ＣＢＭ−Ｓ（液体胞子形成アッセイのために使用される）は、５ ０ｇ／Ｌグルコースを使用し、培養物の接種の直前に５ｇ／Ｌ Ｃａｃｏ３を添加した以外は、ＣＢＭと同一であった。 Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１ ０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中で３ ７℃で増殖させた。 適切なクロストリジウム株のために、培養培地にエリスロマイシン（Erｙ；固体培地では40μ g/mL、液体培地では80μ g/mL）および/またはチアムフェニコール（Th；固体および液体培地では5μ g/mL）を補充した。 カナマイシン（Ｋａｎ；６ ０μ ｇ／ｍｌ）またはクロラムフェニコール（Ｃｍ；２ ５μ ｇ／ｍｌ）を、示されるようにｅ．ｃｏｌｉ培養培地に添加した。 ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍおよびＥ．ｃｏｌｉ株を−８ ０℃で保存した２ ０％ｖ／ｖグリセロール株として維持した。＜５ １ ６ ３＞＜５ ９ ６ ７＞プラスミド構築＜７ ２ ２ ９＞＜１ ４ ８ ７＞オリゴヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（補足表５）によ Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）を全てのＰＣＲ反応に用いた。 C.acetobutylicum ATCC824からのゲノムDNAの単離のために、アルカリ溶解法を使用した71。 Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍを２ｘｙＴＧ培地中で終夜培養し、その時点で培養物１ ０ｍＬを３ ５ ０ ０×ｇで１ ５分間遠心分離した（室温）。 上清を廃棄し、細胞ペレットを5mLのセット緩衝液(75mM NaCl、25mM EDTA pH8.0、20mM Tris-HCl、pH7.5)に再懸濁した。 リゾチームを2mg/mLの最終濃度に加え、溶液を穏やかに混合した。 この混合物を３ ７℃で６ ０分間インキュベートし、１ ５分毎に穏やかな混合を行った。 インキュベーション期間の後、６ ６ ０μ ｌの溶解緩衝液（１Ｍ Ｎａｏｈ、１ ０％ｗ／ｖ ＳＤＳ）を添加し、溶液を十分に混合した。 プロテイナーゼKを0.5mg/mLの最終濃度に加え、溶液を55℃で1時間インキュベートした。 次いで、溶液を３ ５ ０ ０×ｇで１ ５分間遠心分離し（室温）、上部水相をピペッティングによって廃棄した。 有機相に、３Ｍの酢酸ナトリウムを加えた（最終溶液中で１ ０％ｖ／ｖ）。 ゲノムDNAを沈殿させるために、2容量のエタノールを加え、溶液を混合した。 沈殿したゲノムDNAをガラスフックを用いて回収し、70％エタノールで洗浄した。 洗浄したDNAを窒素ガスで15分間乾燥させ、低TE緩衝液(10mM Tris、0.1mM EDTA、pH8.0)に再懸濁し、50℃でインキュベーションすることにより溶解した。
プラスミドpko_mazf_mod（後にpko_pksのテンプレートとして機能する）を構築するために、プライマー pko_foおよびpko_roを使用して、PKO_mazfテンプレートから5.0kb領域を増幅した15。 このステップは、ＰＣＲを介して増幅することができなかったＰＫＯ＿ＭＡＺＦ骨格から６ ７ ７ｂｐ領域を除去するために必要であった。 ０ｋｂのＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｐｓｈａｉを用いて５’末端および３’末端で消化し、連結してｐｋｏ＿ｍａｚｆ＿ｍｏｄを形成し、大腸菌ＴＯＰ１ ０に形質転換した。 形質転換体クローンを精製プラスミド試験消化によってスクリーニングし、最終的なｐｋｏ＿ｍａｚｆ＿ｍｏｄクローンの配列を確認するためにＳａｎｇｅｒ配列決定を使用した。 さらに、プライマー Uhr_FoおよびUhr_Ro、およびDhr_FoおよびDhr_Roを使用して、上流および下流の相同領域（UHRおよびDHR）を表す1kb領域をPCR増幅するために使用された。ｃ由来のｐｋｓ遺伝子（ｃ ａ＿ｃ３ ３ ５ ５）。 acetobutylicum ATCC824ゲノムDNAテンプレート。 クロラムフェニコール/チアムフェニコール耐性遺伝子と構成プロモーター（C.acetobutylicumからP ptb）は、プライマー CMR_FとCMR_R（1.1kb領域）を使用してpko_mazf_modからPCR増幅された。 これら４つのＰＣＲ産物をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを介して連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１ ０に形質転換した。 形質転換体クローンを精製プラスミド試験消化によってスクリーニングし、最終的なｐｋｏ＿ｐｋｓクローンの配列を確認するためにＳａｎｇｅｒ配列決定を使用した。 プラスミドpan315を構築するための（Cへの形質転換の前にpko_pksおよびpcko_pksのメチル化に必要）。 ４ｋｂの領域をプライマー ｐａｎ１＿ｆおよびｐａｎ１＿ｒを用いて増幅し、ベクター ｐｃｏｌａ＿ｄｕｅｔからのｋａｎａｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を含む１． ゲル抽出したＰＣＲ産物をＧｉｂｓｏｎ集合体を介して連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１ ０に形質転換した。 形質転換体クローンを精製プラスミド試験消化によってスクリーニングし、最終的なＰａｎ３クローンの配列を確認するためにＳａｎｇｅｒ配列決定を使用した。 プラスミドpcko_pksを構築するための（Cからの構成的クロトナーゼプロモーター下でのpks遺伝子の発現のための。 ４ｋｂのｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８ ２ ４ｐｋｓ遺伝子（Ｃ Ａ＿Ｃ３ ３ ５ ５）をＧｉｂｓｏｎ組立のための適切な突出部で増幅するために、プライマー Ｃｐｋｓ＿ＦｏおよびＣｐｋｓ＿Ｒｏを使用した。 Ｐｗｉｓ＿Ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ７ １骨格（多重クローニング部位の上流の構成的ｃｒｔプロモーターを含む）を、プライマー Ｐｗｉｓ＿ＦおよびＰｗｉｓ＿Ｒを使用してＰＣＲ増幅し、５． ２つのゲル精製ＰＣＲ産物をＧｉｂｓｏｎ集合体を介して連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１ ０に形質転換した。 形質転換体クローンを精製プラスミド試験消化によってスクリーニングし、最終的なｐｃｋｏ＿ｐｋｓクローンの配列を確認するためにサンガー配列決定を使用した。
プラスミドpet24b_pksを構築するために、5.4kbのC.acetobutylicum ATCC824pks遺伝子（CA_C3355）は、プライマー Pks_FoとPks_Roを使用してC.acetobutylicumゲノムDNAから増幅されました。 二重消化ベクター ｐＥＴ２ ４ｂ（Ｅｃｏｒｉ／Ｘｈｏｉ消化）を二重消化ｐｋｓ ＰＣＲ産物（Ｅｃｏｒｉ／Ｘｈｏｉ消化）と連結し、連結産物を大腸菌ＴＯＰ１ ０に形質転換した。 形質転換体クローンを精製プラスミド試験消化によってスクリーニングし、最終的なpet24b_pksクローンの配列を確認するためにSanger配列決定を使用した。
c.acetobutylicumの電気形質転換
C.acetobutylicumへの形質転換の前に、ベクター pko_pksを電気穿孔法によりPan3と大腸菌TOP10に同時形質転換した。 この手順は、C.acetobutylicum72でアクティブなネイティブ制限修飾システムを克服するために必要なpko_pksのメチル化を許可しました。 Eのプラスミド精製。 大腸菌pko_pks/pan3液体培養を行い、得られたプラスミド混合物は、我々はここで詳細以前に公開されたmethod72を使用してC.acetobutylicumの電気穿孔のために使用されました。 電気competent細胞を調製するために、2xytgプレート（1週以上）からC.acetobutylicumの単一のコロニーを80℃で10分間熱ショックを受け、10mL CGMを接種するために使用した。 37℃で一晩インキュベートし、中間指数相（OD600 0.4〜0.9）に達した後、6mLの培養物を使用して、54mLの新鮮な2XYTGを接種した。 この継代培養は、ＯＤ６ ０ ０ １に到達するまで３ ７℃でインキュベートした。この時点で、継代培養物を３ ５ ０ ０×ｇで２ ０分間遠心分離した（４℃）。 上清を除去した後、細胞ペレットを20mLの氷冷エレクトロポレーション緩衝液(EPB;270mMショ糖、5mM Nah2Po4、pH7.4)に再懸濁した。 再懸濁した細胞を３ ５ ０ ０×ｇで１ ０分間遠心分離し（４℃）、上清を捨て、細胞ペレットを２ ０ｍＬの氷冷ＥＰＢ中に再懸濁した。 3500×gで10分間の遠心分離（4℃）による最終的なペレット化の後、上清を捨て、ペレットを2.3mLの氷冷EPBに再懸濁した。 この最終的な再懸濁液は、電気競争力のある細胞のストックとして使用された。 電気形質転換は、最初に、形質転換されるべき５ ０ ０μ ｌの有能な細胞および〜２ ０μ ｌのプラスミドＤＮＡ溶液（合計１〜５μ ｇ）を混合することによって実施した。 混合物を0.4cmの電気穿孔キュベットに移し、氷上で15分間インキュベートした。 電気穿孔は、電圧、2000V、容量、25μ f、抵抗、無限Ωのパラメータで行った。 電気穿孔の後、試料を１ｍｌの２ｘｙｔｇ中に再懸濁し、９ｍｌの２ｘｙｔｇを含む管に移した。 回収培養物を３ ５ ０ ０×ｇで１ ５分間遠心分離し（室温）、上清を廃棄した。 細胞ペレットを500μ lの2xytgに再懸濁し、100μ lを適切な抗生物質を補充した固体2xytgプレート上にめっきした。 プレートを37℃で2-3日間インキュベートし、形質転換体コロニーをPCRベースの検証に供した。
Pks遺伝子の欠失および遺伝的相補性
Cにおけるpks遺伝子（ca_c3355）の標的KO。 acetobutylicum ATCC824は、以前に公開された方法を用いて達成された15。 詳細には、５μ ｇのメチル化ＰＫＯ＿ＰＫＳ／ＰＡＮ３プラスミド混合物を、上記の方法を用いてＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍに形質転換した。 液体2xytg培地中で4時間回収した後、細胞ペレットを遠心分離（3500×g、15分、室温）によって回収し、0.5mLの新鮮な液体2xytgに再懸濁し、100μ lの再懸濁した細胞培養物を固体2xytg+5μ g/mL Th+40mM β-ラクトースプレート上にめっきした。 これらのめっき条件下では、所望の二重交差相同組換え事象を受けた細胞のみが生存すると予想される。 ベクター骨格の対選択は、pko_pksベクター骨格上の毒素遺伝子mazFを駆動するラクトース誘導性プロモーター（P bgaL）によって提供される。 このめっき手順に続いて、約10コロニーは、2xytg+5μ g/mL Th+40mM β-ラクトースプレート上に観察された。 これらの10個のコロニーのうち、四つは二回restreakedとコロニー PCR検証に供されました。 補足図に詳述したように、４組のプライマーをコロニー ＰＣＲ検証の基礎として使用した。 2.＜５ １ ６ ３＞＜１ ４ ８ ７＞ＰＫＳ遺伝的相補性株を作製するために、上記のようにして、ＰＣＫＯ＿ＰＫＳ／ＰＡＮ３プラスミド混合物を用いてγ ｐｋｓ Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの電気穿孔を行った。 エレクトロポレーションおよび回収の後、培養物を固体２ＸＹＴＧ＋５μ ｇ／ｍｌ Ｔ Ｈ＋４ ０μ ｇ／ｍｌ ｅｒｙ培地上に播種した。 固体２ｘｙＴＧ＋５μ ｇ／ｍｌ ｔ Ｈ＋４ ０μ ｇ／ｍｌ ｅｒｙ培地で２回再培養した後、ｐＣＫＯ＿ＰＫを保有する可能性のあるコロニーを、プライマー ｐＣＫＯ＿ＦおよびｐＣＫＯ＿Ｒを使用してコロニー ＰＣＲを
LC-HRMSメタボローム分析
野生型とγ pks C.acetobutylicumの未標的メタボローム比較のために、各株の単一コロニーを80℃で10分間熱ショックを受け、10mLの液体CGM（30g/Lグルコース）を接種 一晩インキュベーション（停滞）後、OD600-1.0に達するまで、これらの培養物を使用して、10mLの液体CGM（80g/Lグルコース）に、継代培養のための10％接種物を接種した。 -5時間後（OD600-1.停滞した成長のうち、継代培養物を使用して、磁気攪拌棒を介して攪拌された四倍フラスコ発酵（70mL CGM、80g/Lグルコース+5μ L Antifoam204、3％接種物）を接種した。 炭酸カルシウム（６ｇ／Ｌ）をｐＨ緩衝のために発酵培地に補充した。 ある種の抗生物質がＡＢＥ発酵相を撹乱することが知られているので、最終発酵培養物を除いて、約５μ ｇ／ｍｌ Ｔ Ｈがγ ｐｋの全ての培養物に含まれた。 各複製物からの発酵培養液（1mL）のサンプルを初期固定相中に採取し、3mLの2：1クロロホルムメタノールで抽出した。 混合物をボルテックスし、遠心分離（２ ７ ０ ０×ｇ、１ ０分）によって分離し、底部のクロロホルムに富む層をガラスバイアルに移した。 これらの有機抽出物を窒素ガスで乾燥し、１ ０ ０μ ｌのメタノール中に再懸濁し、１ ０μ ｌを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓ Ｐｌｕｓ Ｃ１ ８カラム（４． 0.5mL/分の流量で0.1%ギ酸(vol/vol)を用いたH2O中で40分にわたって2〜98%CH3CN(vol/vol)の線状勾配を使用した。 Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ＸＣＭＳ１ ６（Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して、４倍のＬＣ−ＨＲＭＳデータに基づいて、野生型およびγ ｐｋｓ株のメタボロームを比較した。 Μ pksに固有のMSピーク（Fig. 1a)以下のパラメータを使用して同定した:p値<0.01、倍変化>10.0、ピーク強度>5000。
バイオリアクター発酵
野生型とλ pks CのABE発酵プロファイルを比較する。 アセトブチリカム、バイオリアクター発酵は、500mLの作業容積を有するDASGIPバイオリアクター（4×GPI100容器、DASGIP Bioblockシステム）中で行った。 一晩培養（10mL CGM、30g/Lグルコース、停滞、34℃）c.acetobutylicumの熱ショックを受けた個々のコロニーを接種し、OD600-1に達するまで培養した。 次いで、10％接種物を使用して継代培養を開始し（30mL P2培地、80g/Lグルコース、停滞、34℃）、OD600-1に達するまで継代培養をインキュベートした。 次いで、３ ０ｍＬの継代培養物を、５ ０ ０ｍＬのＰ２培地（８ ０ｇ／Ｌグルコース、１ ０ ０μ Ｌ Ａｎｔｉｆｏａｍ２ ０ ４、３ ４℃）を予め装填した個々のＤＡＳＧＩＰバイオリアクターに無菌的に移した。 発酵は、光学密度測定、発酵生成物分析、および化合物１、２、および３の定量のための定期的なサンプリングを用いて５ ４時間進行させた。 発酵を通して温度を34℃に維持し、200rpmで攪拌することによって攪拌を行い、3M NH4OHの自動添加によってpHを5.0以上に維持した。 嫌気性条件を維持するために、無酸素窒素ガスを、発酵の期間中、２ｓｌ／ｈの速度で散布した。 化合物１、２、および３の定量のために、１ｍｌの発酵ブロスを３ｍｌの酢酸エチルと混合し、ボルテックスし、遠心分離（２ ７ ０ ０×ｇ、１ ０分、室温）によって分離し、上部有機層 有機層を回転蒸発によって乾燥させ、２ ０ ０μ ｌのメタノール中に再懸濁し、２ ０μ ｌを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓ Ｐｌｕｓ Ｃ１ ８カラム（４． 0.5mL/分の流量で0.1%ギ酸(vol/vol)を用いたH2O中で40分にわたって2〜98%CH3CN(vol/vol)の線状勾配を使用した。 化合物１、２、および３は、図１に示されるように、ＵＶ吸収（２ ４ ０ｎｍ）によって同定された。 図1bに示すように、積分ピーク面積（240nmでの吸光度）によって定量した。
発酵分析手順
分光光度計を使用して、600nm（OD600）での光学密度を測定して細胞密度を決定しました。 Biorad Aminex HPX-87Hカラム（300mm×7.8mm）を装着した島津プロミネンスUFLCシステムは、Cを分析するために使用されました。 ブドウ糖および発酵プロダクト（アセテート、酪酸塩、乳酸塩、アセトン、ブタノールおよびエタノール）の集中のためのacetobutylicumの発酵のブロス。 発酵ブロス（１ｍｌ）の試料を、最初に１ ０，０ ０ ０×ｇで３分間遠心分離することによってペレット化し、続いて、０． ろ過された上清（20μ l）のサンプルを、0.7mL/分、35℃のカラム温度で流れる0.01N硫酸移動相でUFLCシステムに注入し、35分間クロマトグラフィーした。 分析物は、屈折率検出器（グルコース、酢酸塩、乳酸塩、ブタノール、およびエタノールの濃度を定量するために使用される）およびダイオードアレイ検出器（酪酸塩（208nm）お
RNA単離およびRNA-Seq分析
発酵ブロスのサンプル（10mL）は、野生型およびλ pks C.acetobutylicum26時間接種後のバイオリアクター発酵から生物学的三重に採取した。 試料を遠心分離し（４ ０ ０ ０×ｇ、１ ０分、４℃）、ペレットを再懸濁し、Ｒｎａｐｒｏｔｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）に保存した。 全ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者の説明書に従って抽出した。 オンカラムＤｎａｓｅ処理は、Ｄｎａｓｅ ｉ（Ｒｎａｓｅ−ｆｒｅｅ）（ＮＥＢ）を用いて行った。 ＲＮＡ品質管理、ライブラリー構築、およびライブラリー配列決定は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ ｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ−Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｑ Ｂ３Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙおよびＶｉｎｃｅｎｔ Ｊ． ＲＮＡの品質および濃度は、ａｇｉｌｅｎｔ２ １ ０ ０Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上のｎａｎｏｃｈｉｐを使用して評価した。 細菌１ ６Ｓおよび２ ３Ｓ ｒＲＮＡを、Ｒｉｂｏｚｅｒｏキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して除去した。 得られたメッセンジャー ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリに変換した。 ＲＮＡライブラリー配列決定は、５ ０ｂｐの単一末端読み取りを伴うＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈ Ｉｓｅｑ４ ０ ０ ０で実施した。 配列決定読み取り（50bp）を処理し、デフォルトパラメータを有するCLC Genomics Workbench9.0を使用して、C.acetobutylicum ATCC824ゲノム（NCBI accession NC_003030.1およびNC_001988.2）にマッピングした。 ゲノムに一意に整列しなかった読み取りは破棄されました。 野生型とγ ｐｋｓｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍの間の遺伝子発現の差を、同じソフトウェアを用いて計算した。 遺伝子は、p値<0.003（対のないt検定に基づいて、n=3）および|正規化された倍変化|>2.0で差動的に発現されると考えられた。 P値に対する偽の発見率補正は、公開されたmethod73を使用してCLC Genomics Workbench9.0で計算されました。 ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析の結果は、補足データ１に示されている。 文字列解析30は、RNA–Seq解析によって明らかにされた差動発現遺伝子間の推定タンパク質-タンパク質相互作用を決定するために行われました。
表現型比較アッセイ
液体胞子形成アッセイは、マイナーな変更74で行われました。 試料は、５日間のインキュベーション（３ ０ｍｌ ＣＢＭ−Ｓ、３ ７℃）の後に生物学的三重液体培養物から採取した。 20μ lのサンプルを熱ショック（80℃、10分）し、希釈（101-106）を2xytgプレート上に発見し、30時間のインキュベーション（37℃）の後にコロニーを列挙し、耐熱コロニー形成単位（cfu/mL）の数を計算した。 液体胞子形成アッセイにおけるγ pksの化学的相補性のために、精製されたクロストリエノース（最終濃度3.5μ m）は、接種時にγ pks C.acetobutylicumのCBM-S培養物に補充された。 化合物３をメタノール中の濃縮溶液として添加したので、当量のメタノール（６ ０μ ｌ）を他の全ての液体胞子形成アッセイ培養物（野生型および非補完λ ｐｋｓ）に加
固体胞子形成アッセイのために、以前に記載されたmethod75は、いくつかの変更を用いて採用されました。 詳細には、熱ショック（８ ０℃、１ ０分間）個々のコロニーを、液体培地（１ ０ｍｌ ＣＧＭ、３ ７℃）中で２ ４時間培養した。 サンプリングは、最初のめっきの1、2、3、4、および6日後に実施した。 試料採取のために、３つの個々のコロニーを合わせ、６ ０μ ｌの液体ＣＧＭ中に完全に再懸濁した。 次いで、再懸濁されたコロニー混合物の20μ lを熱ショック（80℃、10分）し、希釈（101-106）を2xytgプレート上に発見し、30時間のインキュベーション（37℃）後にコロニーを列挙し、耐熱性コロニー形成単位（cfu/コロニー）の数を計算した。 全ての試料を生物学的三重化合物として実施した。
グラヌロース蓄積アッセイは、ヨウ素染色53を介して行われた。 中対数相（OD600-0.6）液体培養物（P2、37℃）は、グラヌロース産生を可能にするために、高いグルコースレベル（50g/L）を有する固体2xytg培地上にめっきした。 プレートを30℃で4日間インキュベートし、その時点でヨウ素結晶のベッドに10分間曝露することによって染色した。 次に、画像化の前に１ ０分間、プレートを固着させた。 Granulose accumulation assayにおけるγ pksの化学的相補性のために、精製されたクロストリエノース（最終プレート濃度4.0μ m）は、γ pks培養のめっき前に固体2xytgプレートに埋め込まれた。 クロストリエノースをメタノール中の濃縮溶液（凝固前に溶融媒体に混合）として2xytgプレートに添加したので、当量のメタノール（6μ l）をgranulose accumulation assayで使用される他のすべ
CBMプレート上で48時間（37℃）培養したC.acetobutylicumの個々のコロニーを見て、Leica DFC300FXカメラを装着したLeica MZ16F解剖顕微鏡を用いて撮像した。
油拡散アッセイは、前述のように実施した76、77、78。 詳細には、400mLのガラスビーカー（内径7.5cm）に300mLの水を充填し、10μ lの液滴のパラフィンランプ油を加え、5分間（直径約25mm）にわたって水面上の薄膜中に広 Surfactin、精製クロストリエノース、およびリン酸カリウム緩衝液コントロールの溶液は、示されたpHおよび濃度（10mMリン酸カリウム緩衝液中で調製）で調製した。 油膜の中心に約10μ lのサンプルを慎重に添加し、油膜への影響を観察した。 界面活性剤活性を有する試料は、油膜中に安定した円形のクリアゾーンを形成することが期待され、より大きなクリアゾーンに対応するより強力なサー 落下崩壊アッセイは、77、79、80を行った。 円形マイクロウェル（内径8mm）96マイクロウェル板（12.7×8.5cm）のポリスチレン蓋内にパラフィンランプ油の薄い層でコーティングされた各ウェルにパラフィンランプ油の2.0μ lを添加し、液滴が1時間にわたってマイクロウェル上に均一に広がることができるようにした。 油拡散アッセイと同様に，サーファスチン，精製クロストリエノース，りん酸カリウム対照の試料を調製した。 サンプルの約5μ lはマイクロウェルの中心に注意深く加えられました。 5分後、液滴の形状および広がりの程度が観察された。 バッファコントロールは、マイクロウェル表面に安定したビーズを形成することが期待されているが、界面活性剤を含むサンプルは、液滴拡散の高度に対応し、より強力な界面活性剤活性で、マイクロウェル表面上に崩壊し、広がることが期待されている。
PKSタンパク質の精製とin vitro分析
in vitro分析のためにHis6タグ付きPKSタンパク質を精製するために、PET24B_PKSを大腸菌BAP1に形質転換した。 約７ｍｌの一晩培養物を使用して、７ ０ ０ｍｌ ＬＢ＋５ ０μ ｇ／ｍｌ Ｋａｎを接種し、培養物を２ ４ ０ｒｐｍおよび３ ７℃で、ＯＤ６ ０ ０ ０． 培養を１ ０分間アイシングした後、イソプロピルチオ−β−ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０に添加した。細胞を遠心分離（5500×g、4℃、20分）によって回収し、25mL溶解緩衝液（25mM HEPES、pH8.0、0.5M NaCl、5mMイミダゾール）中に再懸濁し、氷上での均質化によって溶解した。 細胞残渣を遠心分離（１ ７，７ ０ ０×ｇ、４℃、６ ０分）によって除去し、上清にＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を添加した（２ｍｌ／Ｌ培養）。 混合物を４℃で１時間撹拌し、重力流カラム上に負荷し、Ｐｋｓタンパク質を、緩衝液Ａ（２ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８.０、１ｍ Ｍ ＤＴ Ｔ）中の濃度の増加したイミダゾールと共に溶出した。 精製されたPKSタンパク質を濃縮し、Vivaspin遠心濃縮器を用いて緩衝液A+10％グリセロールに緩衝液を交換した。 精製したＰＫＳ蛋白質のアリコートをアリコートし，液体窒素中でフラッシュ凍結した。 おおよそのタンパク質収量は５ｍｇ／Ｌ（２ ０ ３ｋＤａ）であった。＜５ １ ６ ３＞＜１ ４ ８ ７＞１ ４Ｃ標識基質を用いたＰＫＳ負荷アッセイを、１ ５μ Ｌ、４ｍ Ｍ ＡＴＰ、２ｍ Ｍ Ｍｇｃｌ２、１ｍ Ｍ ＴＣＥＰ、０の総体積中に含有した。１μ Ｃｉ）、１ ０μ Ｍ Ｍａｔｂ、１ ７μ Ｍ ＰＫＳ、および５ ０ｍ Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８． ２ ５℃での２時間のインキュベーションの後、等量の１×ｓｄｓ試料緩衝液を添加することによって試料を急冷した。 ４〜１ ５％ＴＧＸゲル（基準）によるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の後、ゲルを５ ０℃で２時間乾燥させ、貯蔵蛍光体スクリーン（２ ０×２ ５ｃｍ；分子動力学）上に５日間露出させた。 放射性標識タンパク質は、台風9400phosphorimager（貯蔵Phosphorモード、50μ m解像度;Amersham Biosciences）上で画像化された。＜5163＞＜1487＞pksタンパク質のin vitro産物アッセイ（50μ l）のために、PKSの8μ mは、リン酸緩衝液（100mM、pH7.0）中でマロニルCoA（2mM）と室温で2時間インキュベートし、化学 ＮＡＤＰＨ（２ｍ Ｍ）をアッセイに添加して、化合物５および化合物６を生成し、これらの化合物は両方とも化学標準との比較によって同定された。 インキュベーション後、アッセイ混合物を１ ０ ０μ ｌの９ ９％酢酸エチル／１％酢酸（ｖ／ｖ）で２回抽出した。 有機抽出物を乾燥し、１ ０ ０μ ｌのメタノール中に再懸濁し、１ ０μ ｌを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓ Ｐｌｕｓ Ｃ１ ８カラム（４． 0.5mL/分の流量で0.1%ギ酸(vol/vol)を用いたH2O中で40分にわたって2〜98%CH3CN(vol/vol)の線状勾配を使用した。 アッセイ抽出物のＬＣ−ＨＲＭＳ分析を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓ Ｐｌｕｓ Ｃ１ ８カラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ６ ５ ２ ０Ａｃｃｒａｔｅ−Ｍａｓｓ ＱＴＯＦ ＬＣ−ＭＳ装置で行った（４．6×100mm)と同じ溶媒勾配および流量を用いた。
データの入手可能性
本研究で生成されたRNA-seqデータは、arrayexpress(https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)にアクセッション番号E-MTAB-6019で寄託されています。 他のすべての関連データは、要求に応じて著者から入手可能です。