尿路上皮新生物のCk20およびCK5/6免疫組織化学染色：視点

要約

サイトケラチンは中間フィラメントのファミリーに属しています。 それらは細胞の完全性そして機械安定性の重大な役割を担う上皮細胞の非常に特定の方法で表現されます。 いくつかのタイプのサイトケラチンは、正常および腫瘍性尿路上皮に記載されている。 尿路上皮新生物の場合、CK20およびCK5/6の発現は、いくつかの研究で診断および予後への影響を有することが示されている。 したがって、低悪性度尿路上皮癌は傘細胞に限定されたCK発現を示し、高悪性度腫瘍は通常、基底層を除いて尿路上皮の厚さ全体に発現を有する。 一方、CK5/6発現は、すべての低悪性度およびいくつかの高悪性度尿路上皮癌における基底細胞で発現される。 Ck5/6陽性基底層の損失を伴うびまん性CK20染色は、通常、積極的な臨床行動に関連付けられています。 これらのサイトケラチンのスライドの二重染色は、適切な解釈と相関を容易にする可能性がある。

1. はじめに

サイトケラチンは、すべての細胞に存在する10nmの中間フィラメント細胞骨格のファミリーに属しています。 中間フィラメント蛋白質は非常に細胞型特異的な方法で発現され、ここではケラチンは上皮細胞に存在する典型的な中間フィラメントカテゴリーを表 これらのフィラメントは40,000から68,000Mr.まで及ぶ水不溶解性のポリペプチドの複雑なグループです。 上皮では、ケラチンフィラメントはトノフィラメントとして束ねられ、核を編組し、細胞質を貫通し、典型的な上皮細胞-細胞接合部、デスモソームの細胞質プラークに付着することがある。 したがって、ケラチンは、単一上皮細胞と上皮組織の両方の完全性および機械的安定性において主要な機能的役割を果たし、単一細胞から組織形成までの安定性の連続体の固有の部分である。

ケラチンタンパク質は、小さな酸性タイプIと大きな塩基性から中性タイプIIケラチンに分けることができる。 ケラチンのユニークな特性は、他の中間フィラメントタンパク質とは対照的に、それらはタイプIおよびタイプII（1：1）分子の対形成によってのみ糸状 ヒトケラチンの中で、最近のコンセンサス命名法は、ｉ型ケラチンＫ９−Ｋ１ ０、Ｋ１ ２−Ｋ２ ８、およびＫ３ １−Ｋ４ ０、ならびにＩＩ型ケラチンＫ１−Ｋ８およびＫ７ １−Ｋ８ ６を ヒトゲノムでは、ケラチン遺伝子は、染色体17q21.2（K18を除くI型ケラチン）と染色体12q13.13（II型ケラチンおよびK18）の二つの異なる染色体部位にクラスター化されている。 これは、二つのサイトケラチンサブファミリーは、遺伝子重複とCK8とCK18のその後の発散によって生じたと考えられています。

各タイプの上皮細胞は、二から十のサイトケラチンアイソタイプの特徴的な組み合わせを発現する。 したがって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで正常な上皮細胞を、それらのサイトケラチンアイソタイププロファイルに関して同定することができる。 異なる正常上皮細胞型の特徴的なサイトケラチンプロファイルは、腫瘍性形質転換後に保持される傾向があり、この特徴は、腫瘍診断に利用され得る。 しかし、上皮細胞のサイトケラチンプロファイルは、起源の組織ではなく、機能的分化を反映している可能性があります。 したがって、化生細胞は、それらの正常な対応物のそれではなく、その形態のサイトケラチンプロファイル特性を発現する。

2. 発生学的発達中の尿路上皮におけるサイトケラチン発現

サイトケラチンは胚発生中に現れる最初の中間フィラメントタイプであり、胎児発達のある段階のすべての細胞はサイトケラチン陽性である。 発現される最初のサイトケラチンアイソタイプは、CK8+CK18対である。 発生学的上皮間葉転換の間、サイトケラチン発現は、サイトケラチン陰性のままで結合組織に発達するか、または後に二次上皮のサイトケラチンを再発現するかのいずれかの細胞の特定の系統によって失われる。 膀胱の発生学的発達は、消化管および尿排泄物のための共通のチャンバーである後腸構造であるクロアカからである。 発達の4–7週目に、クロアカは、尿直腸中隔によって、後肛門直腸管および前泌尿生殖洞の2つの部分に分割される。 泌尿生殖洞の上部は膀胱を形成する。

膀胱の初期の発達の間、内層上皮は単純な内胚葉上皮から多層の尿路上皮内層に徐々に変化する。 消化管における内胚葉内層のパターンとして、発達している尿路上皮内層は、最初はすべての層においてCK20に対して拡散的に陽性である。 その後の尿路上皮の成熟の間に、基底層が発達し、これはCK5およびCK13陽性によって実証され得る。 Urotheliumのそれ以上の成熟は傘の細胞を除く事実上すべての層のCK20の損失を含みます。 したがって、尿路上皮の発達には3つの異なる段階があるように見える。 第一段階は、基底細胞の欠如およびすべての層におけるCK20発現によって特徴付けられる。 第二段階は基底層の出現によって決定されるが、CK20発現パターンは依然として拡散している。 第三および最終段階では、傘層のみでCK20によって特徴付けられるCK20発現パターンの成熟がある。 基底層は十分に発達しており、CK5/6またはCK13免疫染色によって実証することができる。

3. 正常尿路上皮におけるサイトケラチン発現

膀胱には尿路上皮が並んでおり、尿に対する障壁として機能し、管腔内容積の変化に対応するように特化している。 ウロテリウムは、（1）基底膜の平面に接触し、垂直に配向した細胞からなる基底細胞層、（2）2-5の細胞層からなる中間細胞層の三つの細胞ゾーンを有する多層; （3）後期中間細胞と大規模な、頻繁に二核化、”傘”細胞内腔に直面してその頂端面で構成される管腔または表在細胞層。 傘の細胞はzonulaのoccludensのタイプの細胞の接続と先端の細胞膜のそして細胞内のfusiform小胞の内の非対称的な単位の膜の専門にされたプラークの存在によって特 この外観は、細胞膜内に豊富なウロプラキンが存在するためである。

正常な成体尿路上皮では、CK7、CK8、CK18、およびCK19はすべての尿路上皮細胞層全体で発現し、CK5は基底的に発現し、CK20は傘細胞と関連している（図1）。

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図1

(a)正常な尿路上皮は、基底細胞、中間細胞、傘細胞を含む複数の層の細胞を明らかにする。 （ｂ）尿路上皮の正常な染色パターンを明らかにする免疫組織化学的染色。 傘の細胞はCK20（マゼンタ）によって飾られる。 中間細胞は染色されていない。 基底細胞は、ＣＫ５／６染色（褐色）によって装飾される。

また、いくつかの正常な標本の中間細胞層にはいくつかのCK20陽性細胞が存在する可能性があります。

4. 乳頭状尿路上皮腫瘍におけるサイトケラチン発現

尿路上皮細胞の腫瘍性形質転換は、ほとんどの国で膀胱癌の最も一般的な形態である尿路上皮癌 多くの患者は、非侵襲的（pTa）であるか、または固有層のみに侵入する表在性腫瘍（pt1）を呈する。 再発は一般的ですが（50-70％）、この疾患は通常、局所治療によって制御することができます。 それにもかかわらず、表面的な病気の患者の10-15%は筋肉侵略的な、metastatic病気に結局進歩します。 分化の喪失を特徴とするグレードの増加、および異形成性変化の存在は、両方とも予後不良の決定要因である。 さらに，いくつかの尿路上皮癌は基底／へん平上皮分化を示し，予後不良と関連している。

サイトケラチン20およびCK5/6の免疫組織化学染色パターンは、尿路上皮新生物の種類および性質によって異なる。 例えば、低悪性度の乳頭状尿路上皮腫瘍(PUNLMP)と同様に、umbrella細胞に限定されたCK20と基底層に限定されたCK5/6染色は、正常尿路上皮におけるこれらのケラチンの分布と同一であることを明らかにした(図2)。

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図2

(a)低悪性度乳頭状尿路上皮癌。 （ｂ）傘細胞に限定されたＣＫ２ ０（マゼンタ）発現およびｃｋ５／６染色（茶色）によって描写されたよく形成された基底層を示す免疫組織化学的染色。 （c）基底細胞の染色を伴うが、傘細胞を欠く低悪性度尿路上皮癌。

一方、高悪性度尿路上皮癌は、傘細胞および中間層を含むCK20に対するびまん性免疫反応性を有する傾向がある。 さらに、基底層は、CK5/6陽性によって実証され得る（図3）。

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図3

(a)高悪性度乳頭状尿路上皮癌。 （ｂ）ｃｋ２ ０のびまん性全厚染色およびｃｋ５／６染色によって示される基底層の存在を有する高悪性度乳頭状尿路上皮癌。 （c）基底細胞の拡散存在とCK20のための全厚染色を明らかにする高品位尿路上皮癌。

一方、高グレードの乳頭状尿路上皮癌は、基底層が存在せず、CK5/6の陰性染色を伴う尿路上皮の全厚さにおけるCK20発現を明らかにする（図4）。

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図4

(a)基底細胞の部分的な損失が、ck20のびまん性染色を伴う高悪性度尿路上皮癌。 （ｂ）基底細胞のほぼ完全な喪失を伴う高悪性度尿路上皮癌。 （c）ck20のための拡散免疫組織化学的染色とck5/6のための染色なしで基底層の完全な欠如を明らかにする高品位乳頭尿路上皮癌。

基底層染色の非存在下でのびまん性全厚CK20染色を伴うこのパターンは、固有層または筋肉浸潤を伴う高悪性度尿路上皮癌でも遭遇する特徴である（図5）。

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図5

(a)早期浸潤を伴う高悪性度尿路上皮癌で、ck20細胞質染色が強く、基底細胞が存在しないことが示された。 （ｂ）広範な浸潤を伴う高悪性度尿路上皮癌。 癌細胞はck20に対して拡散的に陽性であるが、基底層は存在しない。

これは、ck20染色のパターンは、尿路上皮癌の診断における形態に有用な補助であることが示唆されている。 また、CK20発現は、低悪性度尿路上皮腫瘍における悪性の可能性を予測することができることが示唆されており、したがって、CK20は、これらの腫瘍を有する患者の治療戦略を定義するのに有用であり得ることが示唆されている。 CK20発現は、いくつかの分化乳頭腫瘍における正常な表在局在パターンを保持するか、すべての細胞層全体に不均一または均一に陽性反応を示す、純粋な尿路上皮癌の大部分によって保持された。 扁平上皮分化を有する癌の部分は、CK20発現の減少を明らかにする。 しかし、これらの領域は、基底層の基底分布とは異なるパターンでCK5/6（図6（a）および6（b））に対して積極的に反応する。

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図6

(a)限局性扁平上皮分化を伴う高悪性度尿路上皮癌。 （ｂ）扁平上皮分化の領域における強力なＣＫ５／６染色を示す免疫組織化学的染色。 残りの部分はCK20のための癌腫の汚れ。 （c）基底へん平上皮形態学的特徴を有する高悪性度尿路上皮癌。 (d)ck5/6の強力な免疫染色とCK20陽性の完全な不在を特徴とする基底扁平上皮癌における免疫組織化学染色。

場合によっては、全体の癌腫はbasosquamous特徴を示すかもしれません。 これらの症例は、CK5/6に対して強い反応性を示し、CK20に対する陽性はほとんどまたはまったくない（図6（c）および6（d））。

最近発表された二つの研究は、CK20およびCK5/6の免疫染色の様々なパターンの臨床的意義に関する追加の証拠を提供している。 これらの研究の一つでは、根治的腎尿細管切除術で治療された上部管尿路上皮癌を有する222人の患者からの腫瘍サンプルは、七つの基底/管腔免疫組織化学マー CK5とCK20を用いて、彼らは上部管尿路上皮癌の四つのサブタイプを定義しました:(i)排他的にCK20陽性およびCK5陰性(ck20+/CK5−)(ii)排他的にCK5陽性およびCK20陰性(CK20−/CK5+)(iii)両方のマーカー陽性(ck20+/CK5+)(iv)両方のマーカー陰性(CK20−/CK5−)

多変量Coxの回帰分析では、CK20+/CK5−サブタイプは独立していた3.83倍の陰性予後マーカーは、他の三つのサブタイプと比較して癌特異的死亡のリスクを増加させた。

第二の研究では、ck5/6およびCK20の免疫組織化学的染色が早期尿路上皮癌の予後と相関することが報告された。 また、CK5/6とCK20発現レベルによって分類された非筋肉侵襲性乳頭状高品位上部尿路上皮癌（UTUC）のサブグループの遺伝子発現プロファイルを研究し、臨床転 これらのサブグループには、CK5/6-high/CK20-low、CK5/6-high/CK20-high、およびCK5/6-low/CK20-highが含まれていました。 CK5/6の発現が低く、CK20の発現が高いことを特徴とする後者のグループは、非筋肉侵襲性乳頭状高悪性度尿路上皮癌の予後が悪いことを予測していた。 転写分析は、サブグループ全体で308差動発現遺伝子を明らかにした。 遺伝子の機能解析は、その高リスク表現型を説明することができ、他のものと比較して、このサブグループで差別的に豊かな共通のプロセスとして細胞接着を同定しました。 後期細胞周期/増殖シグネチャはまた、このサブグループで濃縮された。 したがって、実証可能な基底層の非存在下でCK20のびまん性染色によって特徴付けられる尿路上皮腫瘍は、乳頭尿路上皮癌の最も積極的なサブタイ

サイトケラチン5/6は、正常な角質化表皮および扁平上皮上皮、ならびに乳房、唾液腺および前立腺の基底細胞または筋上皮細胞に存在する。 前立腺および胸のバイオプシーでは、CK5/6は基底細胞の層を飾り、こうして基底細胞を欠いている侵略的な癌腫、後者の診断に有用です。 尿路上皮の構造は前立腺または乳管上皮の構造とは異なり、基底細胞の有無は尿路上皮新生物を良性または悪性型に層化するために使用できない。 しかし、尿路上皮新生物に基底細胞が存在しないことは、予後不良を示す可能性がある。 したがって、基底層が保存された高悪性度尿路上皮癌は、基底層が失われた別の高悪性度腫瘍と比較して、あまり積極的に振る舞うことができる。 私たちの研究室では、これらのサイトケラチンに二重染色を使用しており、これらの染色の適切な解釈に非常に役立ちます。

同様の染色パターンがin situの尿路上皮癌にも見られることがある。 これらの病変は、通常、CK20に対して強く反応性であり、CK5/6陽性基底細胞層を保持していても保持していなくてもよい。 また、ck20陽性染色により、尿路上皮癌のin situ型および癌細胞のpagetoid拡張も認識され得る(図7)。

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図7

(a)Ck5/6陽性の明確な基底細胞層を有するCK20の強力な全厚免疫染色を有する尿路上皮癌in situ。 (b)ck20に対する強い染色および基底層の不在を特徴とする別の尿路上皮癌in situ。 (c)尿路上皮癌のPagetoid拡張CK20ck5/6の反応性基底細胞の複数の層の背景に強い細胞質染色によって実証されました。

少数の症例では、in situ癌は、玄武岩分化を示すCK5/6に対して反応性であり得る。

5. 尿路上皮新生物における発生学的尿路上皮分化対脱分化

サイトケラチンアイソタイプ発現パターンと上皮分化との密接な相関は、サイトケラチンが上皮組織構造および/または機能に重要であることを示唆している。 しかし、正常および腫瘍性上皮細胞の表現型および行動に対する個人またはサイトケラチンアイソタイプの組み合わせの正確な寄与が何であるか したがって、尿路上皮癌再発のリスクが高いことを示すCK20免疫局在化の変化は、おそらくck20が直接関与していることを示すのではなく、発癌中の尿路上皮分化プログラムの調節不全に関連する二次的な変化を反映している。 様々な尿路上皮癌におけるCK20およびCK5/6の発現パターンは、尿路上皮の発生学的発達および分化の段階を模倣する傾向があると推測され得る。 したがって、基底層のないびまん性CK20発現によって特徴付けられる高悪性度尿路上皮癌（浸潤の有無にかかわらず）は、泌尿生殖洞がクロアカから分離した後の尿路上皮分化の初期段階を表す可能性がある。 開発のこの段階の間に、urotheliumは拡散CK20汚損を明示しますが、基底の層を欠けています。 高悪性度尿路上皮癌のいくつかでは、CK20によるすべての層の均一な染色があるが、ck5/6の発現によって実証可能なよく形成された基底層もある。 これは胚性尿路上皮分化の中間段階に相当する可能性がある。 よく分化した尿路上皮癌は、その発現が主に傘細胞に限定されているCK20発現の成熟パターンの存在によって特徴付けられ、ck5/6に対する明確に定義された基底細胞層の免疫反応性も存在する（図8および9）。

図8

(a)尿路上皮の発生学的発達の間の分化の段階を描いた漫画。 初期の段階の間に、開発のurotheliumはcloacaで普通見られるCK20表現を保ちます。 この段階では、基底層は存在しない。 （ｂ）尿路上皮の発生中、基底層は、ＣＫ５／６の染色によって証明することができない。 （ｃ）傘細胞に限定されたＣＫ２ ０の正常な発現およびｃｋ５／６の発現を発現する正常な基底層の存在を伴う尿路上皮分化の最終段階。

図9

(a)ck20発現が傘細胞に限定され、CK5/6を発現する明確に定義された基底層の存在を有する低悪性度乳頭尿路上皮癌における免疫組織化学染色パター （b）高悪性度尿路上皮癌は、CK20を含む基底層を除いて尿路上皮のすべての層でck5/6の発現を明らかにする。 これは、腫瘍の脱分化の中間段階を表す可能性がある。 (c)高悪性度尿路上皮癌では、基底層は存在しないかもしれないが、染色のびまん性CK20パターンは維持される。 これらの特徴は癌腫のさらなる脱分化を示している可能性がある。

このパターンは、子宮内期間中の尿路上皮発達および成熟の最終段階に相当する可能性がある。

要約すると、CK20およびCK5/6に対する尿路上皮癌の免疫組織化学的染色は、尿路上皮癌の性質およびその臨床的挙動に関する有用な情報を提供する

データの入手可能性

この研究を支持するデータは使用されなかった。

利益相反

著者らは、開示する資金や利益相反がないことを宣言しています。

謝辞

著者らは、二色免疫組織化学染色の実施における当社の免疫組織化学研究所の以下の監督および技術スタッフの貴重な支援と技術的専門知識を認めたいと考えています。Rajaa Al Abdulla監督者、huda Ahmed Al Hijji監督者、およびzuhoor Ali上級技術者。