結果
Chrd-/-マウスにおける原腸形成欠損
Chrd分泌されたBmp結合タンパク質は、マウスノードおよびその誘導体、脊索および咽頭内胚葉で発現される（図11）。 1A-F）。 ＣＲ１およびＣＲ３は、Ｂｍｐ４に対して最も高い親和性を示し、アフリカツメガエル胚へのＢｍｐシグナルｓｕｐｏｎｍｒｎａ注入に拮抗することができる（Ｌａｒｒａｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2000). Ｃｈｒｄのヌル対立遺伝子を生成するために，シグナルペプチド領域内の三つの可能な読み取りフレームに翻訳停止コドンを含むターゲティング構築物を調製した。 停止コドンに続いて、ＣＲ１の後に、Ｃｈｒｄ遺伝子をさらに破壊したＩＲＥＳ−ＬＡＣＺおよびＰＧＫ−ｎｅｏカセットのフレームシフトおよび挿入を行った（図１ ０Ａ）。1G）。 このＣｈｒｄｔｍ１Ｄｒ対立遺伝子（以後、Ｃｈｒｄ−と称される）からの転写物は、節段階では検出不可能なｉｎｃｈｒｄ−／−胚であった（図１ ０Ａ）。 1J、アローヘッド）。
ヘテロ接合Chrdマウスは生存可能で肥沃であり、様々な発達のchrd-/-胚を交配したstages.At e8.5日目、我々は、妊娠中の女性の子宮内の再吸収結節の存在と予想される数ofChrd-/-胚の小さな減少を観察した（50は回復し、57は予想される）。 四つの遺伝子型ホモ接合変異胚は、胚領域の大きさの明確な減少を示し、胚の残りの部分に敬意を払ってアラントワの拡大を伴った（図。2A,A’)。 組織学的切片では、かなりの低形成神経板の（Fig.び脊索の欠如（図２Ｂ、Ｂ’）。 の胚外中胚葉細胞の豊富さ（図２Ｃ、Ｃ’）、およびアラントワにおける胚外中胚葉細胞の豊富さ（図２Ｃ、Ｃ’）、およびアラントワにおける胚外中胚葉細胞の豊富さ（ 2D,D’)が観測された。 変異体（46）の残りの部分は、それらのヘテロ接合および野生型同腹仔から形態学的に区別できなかった。 四異常変異体の表現型は、二重ホモ接合性Ｃｈｒｄ；Ｎｏｇｍｕｔａｎｔで観察された中胚葉の腹側化と類似していたが、より顕著ではなかった（Ｂａｃｈｉｌｌｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．,2000)に加えて、神経板の前方切り捨ても存在していた。
Chrd-/-胚の原腸形成表現型。 （Ａ）初期の体節期における野生型および（Ａ’）変異胚。 変異体では、体が減少し、アラントワ（al）が比例して拡大する。（Ｂ−Ｄ’）野生型（Ｂ−Ｄ）および変異胚（Ｂ’−Ｄ’）をＡおよびＡ’で示されるレベルで切片化する。 突然変異体（Ｂ’）の貧弱な分化神経板（ｎｐ）およびその中胚葉の欠如（Ｃ’）に留意されたい。 (D’)変異体のallantoisにおける胚外胚葉細胞の増加。 だから、ソミテ。
ゼブラフィッシュおよびアフリカツメガエルでは、Chrdの不活性化は、腹側中胚葉の伸長および背側中胚葉および神経板の減少を引き起こす（Schulte-Merker et al.,1997). 哺乳類では、原腸形成の間に中胚葉が形成され、原始的な筋を介してエピブラスト細胞が抑制される。 原始的な筋の後端に出る細胞は、胚外領域に移動し、それらはxenopusの腹側中胚葉に相当する中胚葉系統（allantois、羊膜および卵黄嚢のbloodislands）を生じさせる。 対照的に、streakのより前方領域に位置する細胞は、適切な胚の内部に残り、将来の幹の近軸、中間および側板中胚葉を産生する。 Allantoisが胚のmesodermのtheexpenseで拡大されるofchrd-/-突然変異体の早い表現型はマウスの胚の早いventralizationと一致しています。 この表現型は、異常なアラントワを有するホモ接合変異体が後の段階でdissectionsから回収されなかったので、影響を受けた動物の死につながる必要があります。 分子マーカーによるこの表現型の分析非常に少数の異常な胚が得られたために行われなかった。
周産期致死率
出生時に回復したのは予想されるChrd-/-動物の49％（95のうち194）のみであり、すべて同じ完全浸透型を示しています。 これらのうち、大多数は死産であったが、いくつかは肺を膨らませようとしたが失敗した。 外部的には、ホモ接合性変異新生児は野生型同腹子よりもわずかに小さく、チアノーゼ、小頭症および外耳の縮小を示し、眼に異常に近い状態になった（図 3A’）。組織学的検査（Fig.3B’-C’）は、変異体における胸腺（t、第三咽頭パウチの派生物）および二次口蓋（p）の欠如、および内耳（ie）の形成不全を明らかにした。 前内胚葉の頭縁に直ちに隣接する背側口腔外胚葉から誘導されたpituitary腺（pi）の前葉およびpars intermediaは正常であった（Fig. 3C,C’)。 これは、口腔咽頭における表現型の吻側限界を定義し、chrd-expressingendodermの誘導体に限定された奇形を有する。 盲腸孔の腹側咽頭内胚葉に形成される甲状腺は分化したが，低形成で不規則な形状であった（th、Fig. 3C’）。 咽頭パウチ3および4の派生物である副甲状腺は存在せず（データは示されていない）、DiGeorge症候群の個体における新生児低カルシウム血症と一致する観察（DiGeorge、1968）。 Ｃｈｒｄ-／-死産マウスの表現型は，そのような個体に記載された特徴のほとんどを要約した。
Chrd-/-新生児マウスの形態学的および組織学的分析。 （Ａ、Ａ’）野生型（Ａ）およびホモ接合変異型（Ａ’）マウスの外観。 変異体はチアノーゼのように見え、外耳は野生型よりも減少し、目に近い位置に設定されています。 （Ｂ、Ｂ’）野生型（Ｂ）および変異型（Ｂ’）マウスの矢状部分。 変異体では、これらの二次口蓋（p）および胸腺（t）は存在せず、喉頭軟骨（l）は著しくサイズが縮小される。 中枢神経系の全体的な形態および大きさは影響を受けなかった。 （Ｃ、Ｃ’）野生型（Ｃ）および変異型（Ｃ’）マウスの首のレベルでの冠状切片。 内耳（ie）と食道（oe）の欠如、および気管（tr）と甲状腺（th）のサイズの縮小に注意してください。 pi、脳下垂体。
骨格欠損
Chrd-/-新生児動物の骨格調製物では、付属肢および腰部の骨は正常であったが、頭蓋骨の基部および前軸骨格は複数の欠陥を示した。 側頭骨の変化には、側頭骨（st）の欠如および頬骨弓の短縮が含まれていた（Fig.4A,A’)。 また、甲状腺骨および甲状腺および輪状喉頭軟骨のかなりの形成不全も観察された（図10）。 および非正常に小さい顎（図４Ｂ’）を含む（図４Ｂ’）。4C’）。 頭蓋骨の基部では、alisphenoid（as）は正常に見えたが、正中線ではbasioccipital（bo）とbasisphenoid（bs）骨が融合し、presphenoid（ps）は低形成であった（Fig. 4D,D’)。 組織学的所見と一致して，口蓋棚は二次口蓋を形成するために中位に拡張できなかった。 耳では、鼓膜リングおよび耳嚢が減少し、不正な形態であった（図10）。4D’）。 骨格奇形はまた、頚椎および脊柱の胸部領域で観察された。 椎骨体（vb）はChrd-/-新生児では増加していた（Fig. 椎骨の他の要素の遅延骨化および時折の喪失を伴う（図４Ｅ’）、このような骨棘突起、神経弓およびアトラスの前弓（図４Ｅ’）は、椎骨の他の要素の遅延骨化およ 4E’とfig。 5A’）。
野生型および変異型新生児の骨格調製物。 （A-E）野生型ネオン酸塩。 （A’-E’）突然変異体の同腹子。 骨はアリザリン赤で、軟骨はアルシアンブルーで染色されています。 (A,A’)小頭症とthemutant(A’)におけるsquama temporalis(st)の欠如を示すtheskullの側面図。 野生型（Ｂ）および変異型（Ｂ’）における気管および喉頭軟骨；ｔ Ｈ、甲状腺；ｃｒ、輪状軟骨；ｈ ｙ、舌骨。 (C,C’)下顎骨の側面図;変異体(C’)顎におけるthecoronoid(cor),condylar(con)およびangular(an)プロセスの欠如に注意してください。 (D,D’)頭蓋骨の基部の背面図。 as、alisphenoid;pl、口蓋;ps、presphenoid;bs、basisphenoid;bo、basioccipital;tr、鼓室リング;oc、耳嚢。 (E,E’)頚椎の腹側のビュー。 アトラスの前弓（aaa）は変異体であり、椎体（vb）の骨化中心は減少する。
E14.5でのChrd-/-胚の表現型。 （Ａ，Ａ’）野生型（Ａ）および（Ａ’）変異体同腹仔の骨格調製。A’の矢頭は、未発達の椎骨神経弓を示しています。(B,B’)頭蓋の基部の背面図。 Bの矢印は、前脊索の存在。 B’の矢頭は、basisphenoid（bs）とbasioccipital骨（bo）の原基を結ぶcartilaginous橋を示しています。 ocのoticカプセル;lcのlaryngeal軟骨。（Ｃ、Ｃ’）野生型（Ｃ）および突然変異体（Ｃ’）動物の外部図。胚の重度の浮腫（矢頭）と出血に注意してください。 (D,D’)野生型(D)およびchrd-/-(D’)変異型心臓。 ao,aorta;pt,pulmonarytrunk;ta,truncus arteriosus. （Ｅ−Ｆ’）野生型（Ｅ、Ｆ）および突然変異体（Ｅ’、Ｆ’）胚の冠状切片。 変異体（E’）の胸郭では、分割されていないtruncus arteriosusがはっきりと見える。 変異体では、脊索（no）の代わりに拡大した前脊髄動脈（asa、F’の挿入）が見られる。 咽頭（ph）の顕著な減少および変異体におけるeustachian管（eu）の欠如に注意してください。 ダ下行大動脈
Chrd変異体の骨格欠損は、E14.5で既に検出可能なカーチレージ凝縮であった（図。5A,A’)。 基底後頭骨と基底軟骨が融合し、基底後頭骨の骨化中心が狭くなり、基底後頭骨に拡張された（図）。5B,B’)。 野生型basioccipitalのthemidlineに存在していた前脊索は、Chrd変異体には存在しなかった（図。 5B,B’)。 前脊索の欠如は、e14.5における頚部領域の組織学的検査によって確認された（図。5階）。
Chrd変異の影響を受けた骨は非常に異なる起源を持っています。 Basioccipitalは体質起源の全くです;thebasisphenoidの部分は頭の間充織のendochondral骨化から生じます;thepalatineは神経堤derivedmesenchymeの膜内骨化から生じます; 耳嚢は近軸中皮および神経堤細胞の混合物から分化し、舌骨は厳密に神経堤由来である（Le DouarinおよびKalcheim、1999）。 このような系統の多様性の中で、表現型の統一原理は、Chrdを発現する軸間胚葉の近さにおける不正な構造の位置であると思われる（図。 1E）。 この解釈は、Chrd-/-動物における前脊索の観察された早期変性と一致し、頭部のtheskeletonの発達のための前脊索板および中胚葉由来のシグナルの要件と一致している（Belo et al.ら、１ ９ ９ ８；Ｃｏｕｌｙら、１ ９ ９ ８；Ｃｏｕｌｙら、ら、２ ０ ０ ２；Ｄａｖｉｄ ｅ ｔ ａ ｌ．,2002).
DiGeorge様の心臓血管障害
出生時に観察されるチアノーゼは、心臓機能不全の兆候である可能性があります。 これをさらに調査するために、胚発生の異なる段階での解剖が行われた。 E14で。図5に示すように、chrd-/-動物の心臓は、心臓流出路において、通常の二つの代わりに単一の血管を示した（図。 5D,D’,E,E’)。この条件は耐久性があるtruncus arteriosusとして人間で知られ、DiGeorgeシンドロームの個人のanimportant奇形です。 上行大動脈と肺幹との間の分離の欠如は、その肥大を引き起こす右心室の作業負荷、ならびにe14.5胚に見られる血管拡張、浮腫および出血を増加させ 5C’）。 消化管症候群としては、心臓血管系の欠損が外流路を越えて拡張し、咽頭archarteriesから派生した大血管が含まれていた（Fig. 6). 新生児chrd変異体では、総頸動脈がtruncusarteriosusに直接結合し、その結果、腕頭動脈および大動脈弓の一部が存在しない（Fig. 6A-C）。肺動脈は、近位側動脈幹から直接生じ、その結果、共通の肺幹が存在しない（図５）。 6A-C）。 さらに、変異体の40％の異常な右旋回を伴って、横方向の欠陥が観察された（図10）。 6,6,6F)。 後方から解剖を行った場合、下行大動脈の横方向に応じて、右または左鎖骨下動脈が異常な後食道位置を採用していることがわかるであろう（図。 6D-F）。 同様の欠陥は、神経堤細胞切除を伴うニワトリ胚において記載されている（Ｋｉｒｂｙ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ８ ３）、およびＤｉｇｅｏｒｇｅ ｃｏｎｇｅｎｉｃ領域における欠失を有するｉｎｍｉｃｅ（Ｌｉｎｄｓａｙ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ９ ９；Ｍｅｒｓｃｈｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ １）またはＴｂｘ１およびＦｇｆ８における変異（Ａｂｕ−Ｉｓｓａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ２；Ｆｒａｎｋ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ２；Ｊｅｒｏｍｅ ａｎｄ Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，２ ０ ０ １；Ｌｉｎｄｓａｙ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ １；Ｖｉｔｅｌｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ．,2002b)。
野生型（A、D）および2つのChrd-/-（B、C、E、F）新生児の流出路および大血管の正面（A〜C）および前後（D〜F）の図。 耳介は観察を容易にするために除去された。 野生型（A、D）では、大動脈（Ao）と肺幹（Pt）は別々である。 大動脈は左から始まる心室と左に回ります。 下行大動脈（dAo）は、食道（oe）の左側。 腕頭動脈（bc）は、右総頸動脈（rcc）および右鎖骨下動脈（rs）を生じさせる大動脈弓の右側から分岐する。 左総頚動脈（ｌｃｃ）と左鎖骨下（ｌ ｓ）は大動脈弓から直接出てくる。 （Ｂ、Ｅ）左旋回大動脈弓を有する変異動物。 左および右の総状動脈はtruncus arteriosus（Ta）に由来する。 腕頭動脈は存在せず、右鎖骨下は食道の後部に異常に位置する。 左（lpa）および右（rpa）肺動脈は、トランクスの最も近位部分から生じる。 （C、F）右旋回アーチを有する変異動物。 変異体の四十パーセントは、大動脈の異常な右旋回を提示します。 下行大動脈は食道の右側に配置され、左鎖骨下はそれの後部を走る。 観測を容易にするためにいくつかの船が作られている。 rl、右肺;ll、左肺;lpv、左肺静脈;rpv、右肺静脈。
出生時には、予想されるChrdホモ接合変異体のわずか49％が発見された。 しかし、予想される48の56（86％）Chrd-/-胚はまだE14.5で解剖された同腹で生きていた、e8.5（88％）で観察されたものとは有意に異なる周波数notsignificantly。 E14.5後の急激なincreasein致死性は、心血管表現型の完全な発現と一致し、循環不全がchrd-/-胚の致死性の重要な原因であることを示唆している。
咽頭の異常
咽頭表現型の発症を決定するために、我々は異なる時間後にヘテロ接合性交配からpregnantfemalesを解剖しました。 E9で図０に示すように、chrdが咽頭内胚葉中で発現されるastageでは、chrd-/-胚は、頸部領域内の窪みによって同定することができる（図０に示すように、chrd-/-胚は、咽頭内胚葉7A’、矢印）。 変異体の耳小胞は、それらの正常な直径の半分に還元された（図１ ０Ａ）。7A’、矢頭）と第二（舌骨）咽頭弓が欠落していた。 咽頭アーチは、変異胚では形成されなかった（図10）。 およびｄａｔａ ｎｏｔｓｈｏｗｎ）。 欠けているか、または不正な構造はChrd-/-マウスの生れでaredefective器官の多数の開発の間に直接前駆物質または演劇の誘導の役割です。 新生児変異体で観察される現象型異常のほとんどは咽頭内はい葉および咽頭周囲領域に発生起源を有することから，ヒト遺伝性疾患における重要な発症ロールを有することが知られている多くの遺伝子の発現を解析した。
妊娠中期のChrd-/-胚における咽頭欠損。(A,A’)野生型(A)および変異型(A’)E9.0embryosの外部図; 変異体は、耳小胞（矢頭）の還元からなる完全に浸透性の表現型を提示し、第二（舌骨）咽頭アーチの欠如と首（矢印）の顕著なくぼみを示す。 (B,B’)glial細胞を標識するSox10プローブを用いたE9.5胚の全マウントinsituハイブリダイゼーション。 三叉神経（tr）および前庭神経（vc）神経節は、変異体（B’）において脱形成され、置換される。 (C,C’)Pax3Whole-mount In situ hybridization Of E10.5胚。 咽頭周囲領域を通って心臓（h）の近くに移動する神経堤細胞（矢頭）は、変異胚（C’）には存在しない。 ｍｄ、下顎第一咽頭弓の構成要素；ｈ ｙ、舌骨または第二咽頭弓；ｄｍ、皮膚筋小体；ｆｌ、前肢。 からの異常な軸索突起前庭-蝸牛への小脳が示される（矢頭）。 Thepibranchial placode由来のgeniculate（g）、petrosal（p）およびnodose（n）神経節は、変異体には存在しない。 ov、耳小胞;drg、後根神経節。(D-F’)Pax9プローブを用いた全マウントin situハイブリダイゼーション。(D,D’)e9.5野生型(D)および変異型(D’)胚の側面図安息香酸ベンジルで透明になっている。 Pax9咽頭発現は変異体で減少する。 pe、咽頭内胚葉;pg、肛門後腸。 （Ｅ，Ｅ’）同じ胚の背側視野；変異体では咽頭は縮小され、咽頭パウチＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶは存在しない。 (F,F’)e10.5野生型および変異型胚の側面図。 Pax9発現の欠如に注意してください特異的に変異体の咽頭内胚葉（pe）で。 fm、顔面間充織、sc、強皮症。
我々は、神経堤、背側神経管および体節に発現する転写因子であるPax3の発現を最初に調べた（Goulding et al., 1991). Ｉｎｈｕｍａｎｓ、ＰＡＸ３は、Ｗａａｒｄｅｎｂｕｒｇ症候群１型および３型に指定される神経堤疾患において変異し（ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、１ ９ ９ ４）、ｓｏｘ１ ０と共に、微小眼瞼ＯＲＭＩＴＦ遺伝子の共調節因子である（Ｂｏｎｄｕｒａｎｄら、１ ９ ９ ４）。ら、2000）、転写因子は、ヒトのＷａａｒｄｅｎｂｕｒｇ症候群２ａ型において変異した（Ｔａｓｓａｂｅｈｊｉ ｅ ｔ ａ ｌ．,1994). Splotch（Sp2H）マウスにおけるPax3の変異は、永続的なtruncus arteriosus、ならびに胸腺、甲状腺および副甲状腺の奇形を含む心臓の欠陥をもたらす（Conway et al.,1997). 我々は、Pax3発現がe7.5（示されていない）で変異体と野生型胚の間で区別できなかったが、e10.5で有意差が観察されたことがわかった。 咽頭アーチ3、4および6を通って移動するPax3陽性の神経堤細胞（図。 Ｃｈｒｄ−／−動物では検出可能であった（図７Ｃ、矢頭）。 7C’）。 これらの神経クレスト細胞は、大動脈を肺動脈から分離する中隔に移入し、心臓の流出路またはconotruncal領域に移入する（Li et al., 2000). 心臓に到達するための心臓神経堤の失敗は、流出tractseptationの欠如とその後の心血管表現型がinChrd変異体を観察したことを説明しています。 興味深いことに、第一咽頭弓の下顎（ｍ Ｄ）成分、前肢（ｆｌ）の皮膚筋細胞前駆体（ｄ ｍ）および筋芽細胞前駆体などの他の組織におけるＰａｘ３の発現は影響を受けな 7C’）。
次に、Waardenburg症候群4型の個体で変異したSox10とのin situハイブリダイゼーションを行った（Pingault et al.,1998)thatisは神経堤およびSchwann細胞で発現しています。 ５では、SOX10の発現は、Chrd-/-胚および野生型同腹仔で同じであった（データは示さなかった）。 E9.5では、幹の後根神経節（drg）におけるSox10発現は正常であった（図。 しかし、Ｓｏｘ１ ０を発現するグリア細胞の分布は、変異体の首および頭領域における末梢神経系の組織における特異的欠陥を明らかにした（図７Ｂ、Ｂ’）。7B’）。 特に、頭蓋感覚神経節は顕著であった異常。 ＶおよびＶＩＩＩ脳神経に対応する三叉神経（ｔ ｒ）および前庭-か牛（ｖ ｃ）神経節は，野生型同腹仔よりもＣｈｒｄ-／-はいにおいて一緒に位置していた。 さらに、それらの二つを結ぶ異常な神経突起が見られた（図。 7B’、アローヘッド）。 脳神経VII、IXおよびXに対応するgeniculate（g）、petrosal（p）およびnodose（n）神経節は、最も影響を受け、サイズの極端な減少または完全な不在を示していた。 これらの３つの神経節は、枝上placodesから由来し、それらの適切な発達のために前内胚葉からの誘導シグナルを必要とすることが知られている（Begbie et al., 1999). Ｌａｃｋｏｆｐｉｂｒａｎｃｈｉａｌｐｌａｃｏｄｅ由来神経節は，分泌された蛋白質ｒｄが咽頭内胚葉によって放出される誘導シグナルの活性に必要であることを示している。
Pax9は、マウスにおける咽頭内胚葉およびその誘導体の開発に必要な転写因子である(Peters and Balling,1999;Peters et al., 1998). E9で図5に示すように、chrd-/-胚の咽頭内胚葉におけるPax9の発現は、それらの野生型同腹仔よりも弱かった（pe、図5に示すように、chrd-/-胚の咽頭内胚葉におけるPax9の発現は、野生型同腹仔よりも弱かった）。7D,D’)。 Pax9の発現により、Chrd変異体では咽頭の大きさと形状が変化し、咽頭口は最も前の領域で単一の腫脹に減少したことが明らかになった（図。 7E,E’)。 咽頭のhypoplasiaは前の内胚葉がagreatly減少した内腔を輪郭を描く薄い管として現われたE14.5embryosの組織学的なセクションによって確認されました（ph、図。5F,F’)。 咽頭内胚葉の減少は、アフリカツメガエルのＣｈｒｄノックダウンにおいても観察されている（Ｏｅｌｇｅｓｃｈｌａｇｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．,2003). Pax9mRNAが正常に発現している非咽頭領域、例えば体性強膜（sc）および顔面間充織（fm）は、トランスクリプトの分布または存在量に差を示さなかった（図10a）。7F,F’)。
我々は、Pax3、Sox10およびpax9発現の変化は、分泌タンパク質Chrdspecificically Chrd発現内胚葉を囲むperipharyngealregionに作用する局所調節経路を破壊することを示唆し、widerexpressionドメインの非常に限られた領域に制限されていることをこれらの研究から結論付けている。
Tbx1とFgf8の発現は、chordinを必要とします
マウスのcauseDiGeorgeまたはDiGeorge様表現型に知られている遺伝子とChrdの相互作用を研究するために、我々はChrd変異胚におけるtbx1とFgf8の発現を解析しました。 Ｔｂｘ１は、転写因子のＴ−ｂｏｘファミリーのメンバーである（ＰａｐａｉｏａｎｎｏｕおよびＳｉｌｖｅｒ、１ ９ ９ ８）。 これは、ヒトにおけるＤＧＳ／ＶＣＦＳ２ ２ｑ１ １微小欠失内にマッピングされ、最近、不活性化マウスにおいてジゲージ様表現型を引き起こすことが示されている（Ｊｅｒｏｍｅ ａｎｄ Ｐａｐａｉｏａｎｎｏｕ，２ ０ ０ １；Ｌｉｎｄｓａｙ ｅ ｔ ａ ｌ．ら，２ ０ ０ １；Ｍｅｒｓｃｈｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．ら、２ ０ ０ １；Ｖｉｔｅｌｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ．、2002a）。 Tbx1の発現はinChrd-/-胚を変更しました。 野生型E7.5動物では、Tbx1は前腸（将来の咽頭内胚葉）および頭中胚葉で発現している（図10B）。 8A）。 この段階で、突然変異体同腹仔は、同じ領域におけるＴｂｘ１発現のレベルの明確な減少を示した（図１）。8A’）。 Tbx1mRNAの減少は、E8.0、E8.5およびE9.0におけるChrdホモ接合胚の咽頭領域においても同様に明らかであった（図10B）。8B’,C’,D’)。 横断組織学的セクションは、細胞レベルでTbx1転写の存在量が大幅に肝憩室のレベルまで、咽頭および前腸の両方で、内胚葉で減少したことを示した（図。Ｔｂｘ１ｍＲＮＡＷの濃度の減少は、咽頭周囲領域における頭部、棘（矢頭）および有性中胚葉（矢）を含む中胚葉においても明らかである（図８Ｆ−Ｈ’）。8F’,G’,H’)。 さらに、第一咽頭弓の中胚葉コアにおけるE9におけるTbx1発現は、弓の大部分に拡張し、tbx1転写物は耳小胞から吸収された（図。8D-D’）。＜５ ４ ２ ３＞＜１ １ ０ ９＞Ｆｇｆ８は、咽頭内胚葉および隣接する中胚葉を含む種々の組織で発現される分泌成長因子である（Ｃｒｏｓｓｌｅｙ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，１ ９ ９ ５；Ｍａｃａｒｔｈｕｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1995).初期の発達の間、Ｆｇｆ８は原腸形成のために必要とされる（Ｓｕｎ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、1999）および左右対称軸の確立（Meyers and Martin、1999）。 四肢にはｆｇｆ８のAtlater段階が必要である（Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ０；Ｍｏｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，２ ０ ０ ０）および頭蓋顔面（Ｔｒｕｍｐｐら、２ ０ ０ ０；Ｍｏｏｎ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，２ ０ ０ ０）を含む。,1999)開発。 最近の実験は、Ｆｇｆ８活性を低下させたマウスが、Ｄｉｇｅｏｒｇｅ症候群を密接に模倣する心血管および咽頭欠損のスペクトルを提示することを示している（Ａｂｕ−Ｉｓｓａ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ２；Ｆｒａｎｋ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2002). さらに、Ｆｇｆ８発現は、ｔｂｘ１−／−変異体の咽頭内胚葉において廃止され、両方の遺伝子は、咽頭弓動脈の分化の間に遺伝的に相互作用する（Ｖｉｔｅｌｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ．,2002b)。 Ate9、Chrd変異体におけるFgf8発現は、themid-hindbrain峡部、前鼻突起および尾部で正常である。 しかし、咽頭胚葉では、Ｆｇｆ８転写物レベルは大幅に低下する（図１ ０Ａ）。 8E’）。 Chrd-/-胚におけるTbx1とFgf8発現の還元は、両方の遺伝子が同じ調節経路でChrdの下流に作用することを示唆した。 これらの実験は、Chrdisが咽頭および隣接組織におけるTbx1andfgf8の維持または誘導に必要であるかどうかを決定しない。
ChrdがTbx1およびFgf8を誘導できるかどうかをテストするために、我々は四細胞期のxenopus胚の腹側領域にChrd mRNA（50pg）を注入した。 腹側縁帯（ＶＭＺ）外植片を初期原腸で解剖し，兄弟はい到達初期神経節段階まで培養し，ＲＴＰＣＲによって分析した。 Ｔｂｘ１およびＦＧＦ８ｍＲＮＡは、この段階で全胚および背側縁帯（ＤＭＺ）外植片において高レベルで発現され、ＶＭＺ外植片において低レベルで発現された（図１Ｂ）。 8I、レーン1-3）。 マイクロインジェクションにより、Chrd mRNAはVmz中のTbx1およびfgf8のレベルを増加させた（図。 8I、レーン4）。 微小注入アフリカツメガエル胚のIn situハイブリダイゼーションは、Chrd mrnaによって誘導されるTbx1転写産物が咽頭内胚葉に位置することを確認した（データ 我々はthatChrd、Bmpアンタゴニストは、アフリカツメガエル胚におけるTbx1とFgf8発現を誘導することができ、マウス胚の咽頭領域におけるこれらの遺伝子の完