切断されたカスパーゼ-3抗体による標識は、dcp-1drICE二重変異体
に持続する。-カスパーゼ-3抗体、我々は第三齢幼虫からの目のimaginalディスクを分析しました。 野生型の眼のimaginal discでは、抗体はdisc全体に散在するいくつかの死に至る細胞を検出します（図1a）。 驚くべきことに、眼の円板では、ヌル対立遺伝子ｄｃｐ−１ＰｒｅｖおよびＤｒｉｃｅ Δ１について二重に変異している（ｒｅｆ．図14、15）に示すように、切断されたカスパーゼ-3抗体は依然として細胞を標識する（図1b）。 Dcp-1prev drice δ1二重変異体における標識は、クラスター内で起こる(図1b),カスパーゼ-3阻害剤P35.3の発現によって細胞死がブロックされたときに以前に観察されていたものと同様に、これらの観察は、切断されたカスパーゼ-3抗体がまだカスパーゼ-3様タンパク質DCP-1とDRICEの非存在下でエピトープを検出することを示唆している。 それにもかかわらず、この段階でアポトーシスが定義されたパターンで発生しないように、我々はこれらの標識信号の特異性について不確実であった。
切断されたカスパーゼ-3抗体はDRONC活性のマーカーである。 第三齢幼虫の目のimaginal円板を示した。 後部は右にあります。 GMR-hidは、X染色体上のトランスジェニック挿入である。（ａ）切断された−カスパーゼ−３抗体で標識された野生型（ｗ Ｔ）ディスク。 矢印は、いくつかの免疫陽性細胞を指す。（ｂ）切断された−カスパーゼ−３抗体で標識されたヌル対立遺伝子ｄｃｐ−１ＰｒｅｖおよびＤｒｉｃｅ Δ１の円盤二重変異体。 矢印は、いくつかの免疫陽性細胞を指す。（ｃ）および（ｄ）（Ｃ）切断−カスパーゼ−３抗体および（ｄ）ＴＵＮＥＬで標識された別の方法で野生型背景中のｇｍｒ−ｈｉｄ眼ディスク。 目のディスクの後半分の強い信号に注意してください。 （ｅ）および（ｆ）ｄｃｐ−１Ｐｒｅｖおよび（ｅ）切断−カスパーゼ−３抗体および（ｆ）ＴＵＮＥＬについて標識されたＤＲＩＣＥ δ１についてのＧＭＲ−ｈｉｄ眼ディスク二重変異体。 TUNELの分類が完全に妨げられるが、開裂されたカスパーゼ3抗体はまだ目ディスクの後部の半分の強い信号を提供します。（ｇ）および（ｈ）ヌル対立遺伝子ＤＲＯＮＣＩ２ ４のためのｇｍｒ−ｈｉｄ眼ディスク変異体。 (G)切断-カスパーゼ-3抗体および(h)TUNEL標識の両方は、DRONCの損失によってブロックされます。 遺伝子型：（ａ）野生型；（ｂ）ｄｃｐ−１ｐｒｅｖ／ｄｃｐ−１ｐｒｅｖ；Ｄｒｉｃｅ Δ１／Ｄｒｉｃｅ Δ１；（ｃ）および（ｄ）ＧＭＲ−ｈ ｉｄ／ＧＭＲ−ｈ ｉｄ; +/+ , +/+; (ｅ）および（ｆ）ＧＭＲ−ｈｉｄ／ＧＭＲ−ｈｉｄ；ｄｃｐ−１Ｐｒｅｖ／ｄｃｐ−１Ｐｒｅｖ；Ｄｒｉｃｅ Δ１／Ｄｒｉｃｅ Δ１; （ｇ）および（ｈ）ＧＭＲ−ｈｉｄ／ＧＭＲ−ｈｉｄ、ＤＲＯＮＣＩ２ ４／ＤＲＯＮＣＩ２ ４
したがって、我々はさらに切断-カスパーゼ-3抗体の特異性を調べるためにGMR-hid導入遺伝子、よく特徴付けられたアポトーシスモデル、5を使用しました。 Gmr-hid導入遺伝子は、開裂カスパーゼ-3抗体とTUNELラベリングによって示されるように、発達中の眼の後半分に特異的にアポトーシス促進遺伝子hidのGMR駆動型発現を介して、2つの異なる波でアポトーシスを誘導する28(図1c、d)。 切断されたカスパーゼ-3抗体の特異性を評価するために、我々はdcp-1prevとdrice δ1の二重変異体であったGMR-hid眼ディスクを調べた。 予想と一致して、dcp-1prevおよびdrice δ1の損失は、GMR-hidディスクにおけるTUNEL陽性アポトーシスを完全に廃止する（図1f）。 しかしながら、驚くべきことに、ｄｃｐ−１ｐｒｅｖ ｄｒｉｃｅ δ１二重変異体ＧＭＲ−ｈｉｄ眼ディスクは、切断−カスパーゼ−３抗体による強い免疫反応性を依然として示した（図１ｅ）。 したがって、切断された−カスパーゼ−３抗体は、ＤＲＩＣＥおよび／またはＤＣＰ−１を検出しないか、または検出するだけではない。 しかしながら、本発明者らは、切断されたカスパーゼ−３抗体の標識外観が、ＤＣＰ−１およびＤＲＩＣＥの非存在下で変化することに留意する（図１ｃおよびｅを比較する）。 標識信号は、もはや2つの異なる波に限定されるのではなく（図1c）、むしろ眼円板の後部区画全体を満たし、commatidial細胞に限定される（図1e）。 標識パターンの同様の変化は、カスパーゼ阻害剤P35の発現時にCM1抗体標識のために報告されている。3標識パターンのこの変化は、dcp-1prev drice δ1二重変異体GMR-hid眼ディスク内の細胞が死ぬことがなく（図1f）、したがって、切断-カスパーゼ-3抗体によって検出されたエピトープを維持するという事実のためである可能性が高い。 しかし、この分析は、切断されたカスパーゼ-3抗体によるカスパーゼ-3様タンパク質DCP-1およびDRICEの非存在下でのエピトープの検出を示すことに注意するこ
開裂カスパーゼ-3抗体の免疫反応性はアポトソーム成分に依存するDRONCおよびARK
開裂カスパーゼ-3抗体がアポトーシスではないが、dcp-1drICE二重変異細胞を標識する理由は二つの可能性がある。 第一に、抗体は、ｄｃｐ−１およびＤＲＩＣＥの上流に、またはｄｃｐ−１およびＤＲＩＣＥと並行して生成されたアポトーシスエピトープを検出してもよい；または第二に、抗体は、ｄｃｐ−１およびＤＲＩＣＥの上流に、または並行して生成されたアポ これらの可能性を区別するために、我々はDRICEとDCP-1の上流に作用するアポトソーム成分DRONCとARKのGMR-hid目ディスク変異体を調べた。 Ｄｒｏｎｃおよびａｒｋ変異ＧＭＲ−ｈｉｄ眼ディスクでは、ＴＵＮＥＬおよび切断−カスパーゼ−３抗体標識の両方がブロックされる（図１ｇ、ｈ；図３Ａ、Ｂ）。 これらのデータは、切断されたカスパーゼ-3抗体が実際にショウジョウバエのアポトーシスエピトープを検出することを確認する。 さらに、droncおよびark変異体ではアポトーシスエピトープを検出できないが、dcp-1drICE二重変異体では検出できないため、切断されたカスパーゼ-3抗体をdronc活性のマーカーと見なすことがより正確である。
ark変異クローンにおけるΔ N-dcp-1導入遺伝子の発現は、部分的に切断カスパーゼ-3免疫反応性を復元します。 ａｒｋ変異体クローンを含有するｇｍｒ−ｈｉｄ眼ディスクを、切断−カスパーゼ−３抗体（ａ、ａ’）およびＴＵＮＥＬ（ｂ、Ｂ’）で標識した。 ark変異クローンはGFPの不在によってマークされています。 いくつかのクローン境界は、点描線で示されています。 切断されたカスパーゼ-3とTUNELシグナルの両方がarkクローンで失われます。 （ａ’）および（ｂ’）は、切断−カスパーゼ−３およびＴＵＮＥＬチャネルのみである。 遺伝子型：GMR-hid ey-FLP; FRT42D arkg8/FRT42D P(ubi-GFP)。 （ｃ，ｃ’，ｄ，ｄ’）ａｒｋ変異クローンを含むｇｍｒ−Δ Ｎ−ｄｃｐ−１眼ディスクを、切断−カスパーゼ−３抗体（ｃ，ｃ’）およびＴＵＮＥＬ（ｄ，Ｄ’）で標識した。 ark変異クローンは、GFPの不在によってマークされています。 Gfp（緑）でマークされたark+組織では、切断されたカスパーゼ-3およびTUNELシグナルが容易に検出可能である。 Ark変異体クローンでは、切断カスパーゼ3陽性細胞とTUNEL陽性細胞の両方の数が減少するが、いくつかの細胞が存在する（矢印）。 （ｃ’）および（ｄ’）は、切断−カスパーゼ−３およびＴＵＮＥＬチャネルのみである。 遺伝子型：ey-FLP; FRT42D arkg8/FRT42D P(ubi-GFP);GMR-Δ N-dcp-1
トリペプチドETDは、切断されたカスパーゼ-3抗体によって検出されるアポトーシスエピトープである
切断されたカスパーゼ-3抗体によって検出されるエピトープは、DRONC活性に依存する。 抗体が活性化されたＤＲＯＮＣを直接認識することが可能であり得る。 あるいは、切断されたカスパーゼ−３抗体は、ＤＲＩＣＥおよびＤＣＰ−１とは独立して、活性ＤＲＯＮＣによる未知の基質の切断を介して生成されるエピトープを検出することも可
これら二つの可能性を区別するために、我々は、触媒システイン（Cys163）からヒトカスパーゼ-3（カスパーゼ-3ペプチド）のAsp175の切断部位にショウジョウバエのカスパーゼの対応する領域（図2a;参照も参照）に残基を整列させた。 3). カスパーゼ−３ペプチドの最もＣ末端残基であるＥＴＤは、ＤＲＩＣＥおよびＤＣＰ−１において保存されている（図２ａ）。 カスパーゼ−３と同様に、これは、少なくともＤＲＩＣＥ、および場合によってはＤＣＰ−１の活性化のための切断部位である。 興味深いことに、カスパーゼ3ペプチドの3分の2であるN末端がDRONCと最も類似しており、9つの残基のうち6つが保存されている(図2a)。 カスパーゼ-3ペプチドのこの部分は、DRICE、DCP-1および残りのショウジョウバエのカスパーゼではあまりよく保存されていません。 DRONCの大小のサブユニット間の切断は、その活性のために必要ではないが、30、31とin vivoで発生しない可能性がありますが、我々はカスパーゼ3ペプチドのN末端部に向けた抗体が直接死んでいる細胞で活性DRONCを検出する可能性があると考えられました。
ETDを含むペプチドは、切断-カスパーゼ-3免疫反応性をブロックする。(a)ヒトカスパーゼ-3(カスパーゼ-3ペプチド)のAsp175における切断部位への触媒Cys163からの残基とショウジョウバエカスパーゼの対応する領域のアミノ酸配列 赤で強調表示された残基は、カスパーゼ-3ペプチドで同一である。 ＤＲＩＣＥに関して、ＤＣＰ−１およびＤＲＯＮＣ切断は、示された配列の最後の残基（ｄおよびｅ）に続いて実証されている。 崩壊のために、DAMM、DREDDおよびDREAM切断は不確実であり、示されている配列の終わりは切断を意味しない（…で示される）。 下線のある配列を遮断ペプチドに使用した（ｂと比較）。 (b)遮断ペプチドのアミノ酸配列。 ペプチドAのみが切断-カスパーゼ-3抗体の免疫反応性を遮断する。 （ｃおよびｄ）切断されたカスパーゼ−３抗体のペプチドＡによるプレインキュベーションは、ｇｍｒ−ｈｉｄ眼ディスク（ｃ）およびｄｃｐ−１およびＤＲＩＣＥ（Ｄ）に対するＧＭＲ−ｈｉｄ眼ディスク （ｅおよびｆ）切断された−カスパーゼ−３抗体とペプチドＢとのプレインキュベーションは、ｇｍｒ−ｈｉｄ眼ディスク（ｅ）およびｄｃｐ−１およびＤｒｉｃｅ（Ｆ）のＧＭＲ−ｈｉｄ眼ディスク変異体 ペプチドｃおよびｄについても同様の結果が得られた（データは示されていない）。)
我々は、カスパーゼ-3ペプチドのエピトープが切断されたカスパーゼ-3抗体によって死ぬショウジョウバエ細胞で検出されるかを評価するためにブロッ ブロッキングペプチドの配列を図2bに示し、図2aに下線を引いた。 遮断ペプチドＡ（ＴＥＴＤ）は、ＤＲＩＣＥおよびＤＣＰ−１に由来し、遮断ペプチドＢ（ＣＲＧＤＥＹＤＬＧ）は、ＤＲＯＮＣにおける最も類似性の高い領域に対応する（図２ａ、ｂ）。 ペプチドCは、DRONC中のペプチドBにすぐ隣接する残基に対応する対照ペプチドである（図2a、b）。 ペプチドＤは、ペプチドＡに非常に類似しており、位置１ １ ３のＤＲＯＮＣのプロドメインから誘導される別の対照ペプチドである。 ＤＲＯＮＣのプロドメインがこの部位で切断される場合、そのＣ末端にＥＳＤが露出し、これはカスパーゼ−３ペプチド（ｅｔｄ、ペプチドＡ）のＣ末端と非常に類似しており、そ
ブロッキングペプチドを切断-カスパーゼ-3抗体と混合し、眼のimaginal discsとインキュベーションの60分前に行った。 ブロッキング実験の結果を図2bに要約し、ペプチドAおよびBについては図2c–fに示す。 ペプチドＡは、ｇｍｒ−ｈｉｄおよびｄｃｐ−１Ｄｒｉｃｅ二重変異体ＧＭＲ−ｈｉｄ眼ディスクにおける切断−カスパーゼ−３抗体の全免疫反応性を遮断するのに十分である（図２ｃ、ｄ）。 対照的に、ペプチドＢは、これらの円板中の抗体の免疫反応性を停止しない（図２ｅ、ｆ）。 対照ペプチドＣおよびＤもまた、切断−カスパーゼ−３免疫反応性を遮断することができない（図２ｂ；データは示されていない）。
これらのデータは、切断されたカスパーゼ-3抗体がアポトーシス細胞のエピトープETDを特異的に検出することを示している。 ショウジョウバエのカスパーゼの中で、このエピトープはDRICEとDCP-1にのみ存在するため、抗体が実際にこれらのエフェクターカスパーゼを検出する可能性が非常に高い。 対照的に、ＤＲＯＮＣ由来ペプチドＢ、ＣおよびＤが免疫反応性を遮断しないという事実は、抗体が活性ＤＲＯＮＣを直接検出することはまずないことを示唆する。 したがって、切断されたカスパーゼ-3抗体は、dcp-1drICE二重変異体において免疫反応性を失わないため（図1e）、少なくとも一つの他のタンパク質を検出し、ETDエピトープをDRONC依存的に露出させる。
ARKとは独立してDCP-1を活性化すると、切断カスパーゼ-3免疫反応性が回復する
図2に示された分析は、切断カスパーゼ-3抗体が切断DCP-1とDRICEを実際に検出することを示唆しているが、証明していない。 この可能性を直接テストするために、我々はark変異体の背景にGMR-Δ N-dcp-1導入遺伝子を発現した。 Δ N-dcp-1はDCP-1のN末端プロドメインを欠いている。 これは、プロドメイン枯渇Δ N-DCP-1は容易に自動処理を促進し、GMR制御下で一貫した発現は、眼のアブレーション表現型を誘導すると考えられている。32この眼の切除表現型は、アポトーシスの誘導によって引き起こされる（図3c、d）。 上記のように、GMR-hid背景のark変異体クローンはTUNEL陽性アポトーシスを誘導することができず(図3b)、切断されたカスパーゼ-3抗体はarkクローンでは免疫反応性を有さない(図3a)ことから、ark変異体クローンではDCP-1もDRICEも未知のDRONC基質も切断されていないことが示唆されています。 したがって、我々は、アポトソーム活性の非存在下でΔ N-Dcp-1の発現は、arkクローンでは、切断-カスパーゼ-3抗体標識を復元することができるかどうかを試験した。 野生型組織（図3c、c’でGFPによってマーク）と比較して、切断-カスパーゼ-3陽性細胞の数は、ARK変異クローン（図3c、c’）で強く減少し、Δ N-DCP-1の活性化がアポトソームに少 しかし、ＧＭＲ−Δ Ｎ−Ｄｃｐ−１背景中のａｒｋ変異クローン（ｎ＝３ ２）の約５ ０％は、切断−カスパーゼ−３免疫反応性細胞（図３ｃ、ｃ’中の矢印）を含む。 これらの細胞もTUNEL陽性であるため、これは標識アーティファクトではありそうにありません（図3d、d’）。 したがって、droncは切断カスパーゼ-3標識シグナルが未知のDRONC基質によって引き起こされないことを示唆ark変異体の背景に不活性であるため、この分析は、 Ｄｃｐ−１は、少なくともｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＲＩＣＥをタンパク分解性に処理することができるので、切断−カスパーゼ−３抗体がこの実験で切断ＤＲＩＣＥを検出することも可能である。ＧＭＲ−ＤＲＩＣＥおよびＧＭＲ−Δ Ｎ−ＤＲＩＣＥは眼切除表現型を引き起こさないので、ＤＲＩＣＥと同様の分析を実施できなかった。それにもかかわらず、DCP-1がIN vivoでDRICEを切断するかどうかにかかわらず、large subunitのC末端でのdcp-1とDRICEの配列類似性および図2のペプチドブロッキングデー