ヒト血液サンプル中のCNPとNT-proCNPの比較測定:方法論的評価

はじめに

C型ナトリウム利尿ペプチド(CNP)、1990年にSudohらによって同定された。、natriureticペプチッド家族の古代メンバーはあります。 CNPは選択的にcGMPの細胞内濃度を上昇させることによってcGMP依存性キナーゼ（cGK）を活性化するヒトナトリウム利尿ペプチド受容体2（NPR2）を刺激する。 さらに、CNPはNPR3に結合し、アデニル酸シクラーゼのGiタンパク質依存性阻害によってプロテインキナーゼAを不活性化する。 CNPは抗増殖性および抗遊走性を有し、内皮由来の弛緩因子としても同定された。 さらに、CNPは新内膜再狭窄を阻害し、血管収縮リモデリングおよび心臓虚血再灌流損傷を減少させる。 CNPは、骨の成長、再生、神経の成長、再内皮化、ならびに腎臓、膵臓、および心機能において重要な役割を果たす。 加えて、ＣＮＰは、アテローム性動脈硬化性プラーク形成の発生に関与することが最近認識されている。

CNP機能の過多が原因で、このペプチッドは過去年の間に心血管の研究の増加する興味を達成しました。 しかし、血液サンプル中のCNP濃度に関する研究は矛盾しています。 これらの研究のいくつかは、血清試料中のＣＮＰまたはそのアミノ末端プロペプチド（Ｎ ｔ-ｐｒｏｃｎｐ）の濃度を測定し、他のものは血漿試料を使用した。 残念なことに、採血中の潜在的な遅延およびその後のサンプル処理の詳細はまだ報告されていない。 これまでの入手可能な文献では、血清試料と血漿試料との間のＣＮＰ／ＮＴ−ｐｒｏＣＮＰ濃度の差に関するデータは存在しない。 また、血液サンプル処理の遅延の影響は不明のままである。 さらに、血清および血漿試料中のCNP濃度は著しく変化した（表1）。 したがって、本研究の目的は、以下の方法論的な質問に答えることでした：（1）室温で保存された血液サンプルの遅延処理はバイアスを引き起こすか？ （2）CNPまたはNT-proCNPの血清および血しょう集中の間に相違がありますか。 (3)これらの相違は時間依存しているか。

方法

12人の男性ボランティア（平均年齢29±2年、正常体重、薬物療法なし、心血管疾患または他の疾患の病歴なし、3喫煙者）を研究しました。 全調査対象者からインフォームドコンセントを得た。 空腹時の血液サンプルの三つ子は、朝の8時にすべてのボランティアから採取されました。 ５ｍｌ Ｓ−Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して血液試料を収集し、血清試料には凝固活性化剤（カオリン）、血漿試料にはクエン酸ナトリウム、または全血液試料には ベースライン分析のためのすべての試料を直ちに２，０ ０ ０×ｇで４℃で１ ０分間遠心分離し、分析まで上清を−７ ０℃で保存した。 中期分析（３ ０分または２時間）のために、血漿試料を、室温で１ ０分間、２，０ ０ ０×ｇで遠心分離した。 上清を除去し、室温で３ ０分または２時間保存した。 血液凝固後、血清試料を血漿試料と同様に処理した。 上清を保存し、室温で30分または2時間保存した。 完全な血液サンプルを遠心分離なしで室温で保存した。 ３ ０分または２時間後、全血液試料を２，０ ０ ０×ｇで４℃で１ ０分間遠心分離した。 ＣＮＰの濃度は、ＣＮＰ−２ ２Ｅｉａキット（＃ＥＫ−０ １ ２−０ ３，Ｐｏｌｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って測定した。 ＮＴ−ｐｒｏＣＮＰ濃度は、ＮＴ−ｐｒｏＣＮＰ ＥＩＡキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、製造業者のプロトコールに従って測定した。 群間の比較のために、一方向Ａ ＮＯＶＡを使用した。 ペアワイズ比較のために、ｔ検定を適用した。 データは、平均±標準偏差（Ｓ Ｄ）または９ ５％信頼区間（９ ５％−ＣＩ）として示す。 統計的有意性はp<0.05で仮定した。 ０（Ｍｅｄｃａｌｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用してデータを分析した。

結果

図1aに示すように、血清、血漿、および全血液サンプル中のCNPのベースライン濃度は、それぞれ0.997±0.379ng/ml、1.933±0.699ng/ml、および0.991±0.489ng/mlであった。 ＣＮＰの血漿濃度は、すべての時点で血清試料および全血液試料と比較して有意に高かった（Ａ ＮＯＶＡ、ベースラインでのｐ＝０． そして１ ２ ０分でｐ＝０．). いずれの時点においても、血清試料と全血液試料との間に有意差は観察されなかった（ANOVA、p>0.05）。 血清、血漿、および全血液サンプル中のNT-proCNPのベースライン濃度は、それぞれ58.5±28.3pg/ml、60.3±23.9pg/ml、および50.7±21.4pg/mlであった（図1b）。 いずれの時点でもグループ間に有意差は認められなかった（ANOVA、p>0.05）。 完全な血液サンプルでは、乳酸塩の濃度は、ベースライン値と比較して2時間後に有意に増加した（3.2±0.8mM対2.0±0.6mM、p<0.001）。 さらに、pH値は7.34±0から減少した。03ベースラインで7.29±0.03 2時間後に(p<0.001)。

議論

私たちの研究では、CNPとNT-proCNPは、室温で少なくとも二時間、血清および全血液サンプル中で安定であることを明らかにしました。 その結果、ＣＮＰペプチドの安定性は、少なくとも２時間の試料処理のいかなる遅延によっても影響されない可能性が最も高い。 ProCNPは、少なくとも2.5時間安定であることが既に報告されている（製造業者のプロトコル、血液試料の未知の貯蔵条件）。 その結果，室温でもＮ ｔ-ｐｒｏｃｎｐの安定性が確認された。 すべてのサンプルタイプにおけるNT-proCNPの濃度は、このタンパク質の長期的な安定性を示す、最大2時間の時間経過中に一定のままであった。 表1に記載されているように、NT-proCNPの平均濃度（56.5±24。この研究で測定された3pg/ml）は、健康な個体（3.7-432pg/ml）の報告された範囲（表1参照）内であった。

NT-proCNPとは対照的に、CNPの濃度は血清および全血サンプルと比較して血漿サンプルで有意に高かった（図1）。 これまでのところ、私たちのグループも製造業者の技術サービスも、この研究で使用されたELISAアッセイに対するサンプルタイプの影響に関する証拠を見つ しかし、ベースラインでは、血漿および全血液サンプルの上清は、使用された血液凝固阻害剤のタイプを除いて同一であった。 この阻害剤は血しょう群ではくえん酸ナトリウム，全血液群ではＥＤＴＡであった。 完全な血液サンプルは、血清サンプル（p=0.98）に匹敵する結果を明らかにした。 したがって，クエン酸ナトリウムは血しょう中のＣＮＰの測定濃度に有意に影響し，その結果，この技術によって達成された結果を改ざんする可能性が最も高い。

予想外に、血漿試料と血清試料の両方におけるcnpのベースライン濃度は、他の報告よりも約1000倍高かった（表1）。 これらの研究のすべてにおいて、放射性免疫測定法（ＲＩＡ−Ｋｉｔ）をＣＮＰ濃度の決定に使用した。 対照的に、他の二つの研究では、血清および血漿試料中の測定されたCNP濃度は、寸法の大きさに関して我々の結果に匹敵した。 興味深いことに、後者の研究では、我々の調査と同じELISAキットを使用した。 様々な内部および外部要因の広範な評価の後でさえ、この不一致の満足する説明は見つからなかった。 ヒト血清中の外因性CNPを用いたコントロール測定は、+7.8％（95％-KI：-）の非有意な測定誤差を明らかにした。 基準曲線に使用したＣＮＰペプチドは、製造業者自身（Ｐｈｅｎｉｘ）によって合成された。 対照的に、「外因性」対照として使用されたＣＮＰペプチドは、Ｂａｃｈｅｍによって提供された。 両方の製造業者によって保証されるように、アミノ酸の配列は同一であり、両方のペプチドでジスルフィド結合が形成された。

ただし、内部統制測定の結果は以下のように要約することができます: まず、我々の研究で行われた対照測定は、ELISAキットが製造業者の指示に従って適切に使用されたことを明らかにした。 第二に、対照試料を用いた測定は、適用される標準曲線の適合性を確認した。 第三に、外因性CNPを含む対照血清サンプルは、許容可能な精度を明らかにし、結果は期待される大きさのオーダー内であった。 第四に、血漿試料中のＣＮＰの高濃度は、クエン酸ナトリウムによって引き起こされるアーティファクトである可能性が最も高い。

Clericoと同僚によって報告されているように、ANPやBNPなど、異なるRIAとEIAの方法間で結果の比較可能に大きな違いが知られています。 Clericoと共同研究者は、これらの結果の大きな違いは、使用されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体の特異性、免疫測定システムの設計（競合対非競合アッセイ）、使用される分析マトリックス（血清対EDTA対ヘパリン化血漿）、およびanpおよびBNPイムノアッセイについて以前に報告されているように、ナトリウム利尿ペプチドの循環形態の過多に起因する可能性が最も高いと結論づけた。 これらの方法論的バイアス源は、CNPおよびNT-proCNPアッセイについても考えられ、引用された研究における結果の大きな違いを説明することができる（表1）。

研究の制限

我々は、12のサンプルサイズが全く違いがないと結論づけるには小さすぎることを認識しています。 しかし、統計的な観点からは、その差が医学的に関連するものでなければならないかどうかを指定することが重要であろう。 私たちの知る限り、後者はまだ明確に定義されていません。 したがって、すべての読者がデータから独自の解釈を引き出すことを可能にするために、すべての測定値の平均と95％信頼区間が図に示されました。

血清および血漿濃度に関しては、表1に報告された値は、異なる疾患に罹患している患者において異なる方法（RIA、ELISA）で測定されたことに言及する必 大きさのオーダーの千倍の相違が顕著に残るので同じ標本を使用して直接CNP-ELISAの試金とCNP-RIAを比較することは非常に有用でした。 残念ながら、RIAの試金の測定は私達の実験室で利用できなかった。 ＮＴ−ｐｒｏＣＮＰ濃度について、後者の比較を、Ｏｌｎｅｙおよび共同研究者によって調査し、市販のＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｍｅｄｉｚｉｎｐｒｏｄｕｋｔｅ Ｇｍｂｈ＜３ ４ ９ ８＞Ｃｏ ＫＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）が、ＲＩＡ値の平均２ １％（１ １〜５ ２％の範囲）である値を与えたことを示した。 RIAの試金を使用してELISAのキットの参照標準の交差検証は15%の不一致を示しました。

概要

CNPおよびNT-proCNPの測定値は、サンプル行列の遅延または血液サンプルの種類（血漿サンプルのCNPを除く）の影響を受けなかった可能性が最も高い。 血しょう試料については，ＥＤＴＡ抗凝固血液試料のみが本研究で使用されたＣＮＰ ＥＬＩＳＡアッセイに適していた。 その結果、ＣＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＣＮＰの濃度は、ｃｎｐ効果を決定するために臨床応用において使用することができる。 また、活性ペプチドの副産物であるNT-proCNPの濃度は、CNPの真の性質を隠す可能性があることも考慮すべきである。 しかし、RIAアッセイまたはELISAアッセイによって決定された測定されたCNP濃度の不一致はまだ説明されていないままであるが、方法論的な問題に起因する可能性が最も高いと思われる。 従って、ANPおよびBNPのために推薦されるように、CNPのための免疫学的検定はまた将来標準化されるか、または調和させる必要があります。