デフォルトでは、顕微鏡は生物学的事象を測定するのではなく観察し、いくつかの計算に基づいてではなく、私たちが見るものに基づいて結論を したがって、この記事のトピックは、共局在化の測定値を扱うので、少し驚くべきように見えるかもしれません。 タンパク質の共局在を視覚的に判断できる状況がありますが、2つのプローブの相互分布のより正確な確認が必要になることがよくあります。
なぜ共局在化の視覚的決定が不十分なのですか？
共局在解析のための制御されたプロトコルに従って画像を収集した場合にのみ（各チャネルで十分な信号、自家蛍光または信号ブリードスルーなし）、二つのプ この場合、緑色信号が赤色信号と共局在し、画像がほとんど黄色である場合、統計的測定は必要ありません。 しかし、重複が表示されない場合、それはそこにないという意味ではありません！ 2つのチャネルの強度が同じではないことがあります。 つまり、私たちが見る中間の色は、両方のプローブが同じ強度である場合にのみ現れることができます。 したがって、視覚的決定に基づく結論は、しばしば偽陰性の結果につながる可能性があります。
オーバーラップ測定にはどのような方法がありますか？
この問題に対する標準的なアプローチはありませんが、広く使用され、一般的に受け入れられている二つの方法があります。 これらは、ピアソンの相関係数（PCC）またはマンダーの共局在係数（MCC）のいずれかを含む。
これらの二つの方法は、共局在化の二つの異なる側面に関連しています–相関と共起。 ピアソン係数は、2つのチャネルのピクセル強度の相関に関連しています。 一方のチャネルの信号値が他方のチャネルと同時に上昇するか、他方のチャネルが上昇すると一方の信号が下降するか、信号間の関係を測定します。 相関は、マンダー係数によって数学的に表現される共起とは異なる。 これは、一方の信号が他方の信号を超えるカバレッジを表し、2つのプローブが同じ場所を占める程度を明らかにします。 これをもう少し詳しく見てみましょう。
ピアソンの相関係数（PCC）
定義：PCCは、信号強度間の線形関係を反映しています。 値の範囲は1(完全な正の相関)から-1(完全な負の相関)の間であり、0は相関がないことを意味します。 プロット上の座標が両方のチャネルのピクセル値（信号）を表す散布図を介してPCCを視覚的に探索することができます。 直線の周りに集まる点が多いほど、2つの信号間の相関が良くなります
要件：偽陽性または陰性を避けるために、関心領域（ROI）でPCCを測定する必要があ 画像全体にわたってPCCを測定すると、背景のピクセルは完全に相関し、PCCを膨らませます。 対照的に、両方のチャネルの不均一な分布が存在する関心のない領域で測定が実行される場合、ＰＣＣは抑制されるであろう。
ROIを手動で選択するか、しきい値で背景を除外することができます。 どちらの方法でも、特にしきい値を設定するときは注意してください。 ＲＯＩの選択は、細胞（複数可）のすべての関連領域、すなわち、プローブが分配することが期待され得るあらゆる場所を含む必要がある。 ROI(しきい値)を選択するために強度ベースの方法を使用している場合は、誤って関連する結果を除外する可能性があります。 どのようにこれが起こることができますか？ どちらのラベルも表示されない相互排除の領域を持つことができ、これは生物学的に関連する結果になる可能性があります（両方の分子は細胞内の ただし、しきい値処理ではこの領域はROIに含まれないため、関連する結果が失われる危険があります。
推奨：強度間に線形関係がある場合は、画像にPCCを使用する必要があります。 データがより複雑なモデルに適合する場合、PCCはうまく機能しません。 プローブが共分散するが、比率が異なる不均一な重複がある場合は、別の方法を選択する必要があります。 これは、GFPを1つのプローブとして使用する場合に発生する可能性があります。 その発現レベルは、細胞間で異なる可能性があり、潜在的に高い細胞間変動のためにPCCのうつ病を引き起こす可能性があります。
Mander’s Colocalization Coefficients
定義：MCCは、共起を記述するメトリックであり、一方のタンパク質の割合であり、他方のタンパク質と共局在する。 MCCは、小胞の中の1つのタンパク質にラベルを付け、それが細胞内の特定の構造、例えば微小管とどのように共局在するかを見たいときに、共局在の良 すべての小胞が微小管と共局在するが、微小管の一部のみが小胞と共局在すると仮定すると、各チャネルのMCCを計算し、この分数の重複を定量的に表
要件：MCCのキャッチは、バックグラウンドの排除が必要であるということです。 ここで最もトリッキーな部分は、背景減算を有効にする強度のカットオフポイントを設定しています。 MCCは、ゼロ以上のピクセルごとに一つのプローブの完全な蛍光を測定します。 ただし、ゼロピクセル以上は、次のような要因のために非常にまれです: 自家蛍光、光漏れ、非特異的ラベリング、または焦点外画像からの蛍光。 したがって、MCCの測定には、しきい値（カットオフ）を慎重に選択する必要があります。
これを行う最初の方法は、グローバルしきい値処理であり、各ピクセルからしきい値を減算するため、選択したカットオフの下のすべてのレベルが背景になり、上のすべてのピクセルが関心のある領域に分類されます。 これは非常に直感的ですが、グローバルしきい値はかなり粗雑であり、背景に近いが実際には肯定的な低値ピクセルの除外のような不要な状況につ
より自動で主観的ではないオプションは、PCCを複数回計算することによって閾値を推定するCostes法です。 これは、正であり、したがって除外すべきではないピクセル値の範囲を定義するのに役立つ。 ＰＣＣは、異なる画素群について計算され、ＰＣＣがゼロに等しいか、またはゼロに近い画素値が閾値として取られる。 それにもかかわらず、信号対雑音比が低い画像では、標識された構造と背景を区別しないように、非常に低いしきい値レベルを識別する可能性があ
推奨対象:実験の生物学的な問題がタンパク質/構造が重複する程度に関係する場合、MCCは選択の尺度でなければなりません。 これらの係数は、PCCよりも直感的に解釈され、信号の比例性（各プローブによって標識された構造の数の差）とは無関係です。
分析を開始する前に
共局在化を測定するためのいずれの選択を選択しても、画像収集が正しい方法で実行されることは非常に重要です。 できるだけ多くの因子を制御し、できるだけ多くの変数を監視できるようにする一連の対照サンプルを準備してください。
視覚的な共局在化の決定は、観察者の主観性、各個人の脳が色を異なるように見ることができるという事実、観察者の色盲の可能性、ピクセルサイズを決定する空間分解能など、多くの要因によって影響されることに注意してください。 あなたが均一な方法で分析しようとしている画像を処理し、制御されていない操作は、関連する情報を失う可能性があることに注意してください。
そして最後に
これらの計算は、ImageJやVolocityなどのほとんどの画像解析ソフトウェアパッケージに実装されています。 しかし、共局在化を測定することはまだ幾分交絡する分野であることを考えると、改善が必要なので、ソフトウェアの新しいバージョンとパッケージを追跡
共局在化をどのように測定しますか？ 私たちはコメント欄に書くことによって知ってみましょう！
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