Reagents
シスプラチンおよび３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ Ｏ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。 プラスチック培養材料は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（ＦＲＡＮＫＬＩＮ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。 ダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）、および他の組織培養試薬は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃから入手した。 （ゲザースバーグ、MD、米国）。 組換えマウスＩＬ−４およびＩＬ−１ ３タンパク質、ｉｌ−４、ＩＬ−１ ３、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６に対する抗体、およびサイトカイン用の酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｌｉｓａ）キット（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅｒ）を、Ｒ＜６ ５ ５ ０＞Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃから購入した。 （ミネアポリス、ミネソタ州、米国）。 これらの抗体は、1:200の濃度で免疫組織化学のために使用された。 Ｐ−ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ４、ｐ−ＳＴＡＴ６、ＳＴＡＴ６、ＮＦ−κ Ｂ（ｐ６ ５）、およびＩ Κ Ｂに対する抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ． （サンタクルーズ、カリフォルニア州、米国）。
細胞培養と生存率
条件付きで不死化されたHEI-OC1聴覚細胞の確立と特性評価は、我々の以前のレポート1に記載されていました。 Math1およびミオシン7aなどのOHC特異的マーカーの発現は、HEI-OC1細胞がOHC前駆体を表すことを示唆している。 ＨＥＩ−ＯＣ１細胞を、１ ０％ＦＢＳを含有する高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中に維持した。 以下に記載される実験のために、ＨＥＩ−ＯＣ１細胞を、１ ０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ中で、３ ３℃および５％ＣＯ２の許容条件下で培養した。 細胞の生存率を決定するために、MTT（0.25mg）を1ml細胞懸濁液に4時間添加した。細胞を洗浄した後、pbs（pH7.4）で3回洗浄した後、不溶性ホルマザン生成物をDMSOに溶解した。 次いで、各培養ウェルの光学密度（ＯＤ）を、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ，Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて５ ９ ０ｎｍで測定した。 対照細胞のＯＤを、１ ０ ０％生存率を示すために採取した。 ＜３ ３ ６ ９＞＜２ ３ ２ ２＞動物＜６ ４ ７ ９＞＜３ ２ ５ ７＞ＳＴＡＴ４−／−（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｎ１ ０）、ＳＴＡＴ６−／−（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｎ６）、およびＷＴ ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈ Ａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。＜３ ３ ６ ９＞＜２ ３ ２ ２＞動物＜６ ４ ７ ９＞、ＳＴＡＴ６−／−（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｎ６）、およびＷＴ ｂａｌｂ／ｃマ ホモ接合STAT4およびSTAT6KOマウスはPCRによって同定された。 ＫＯマウスは発達異常を示さなかった。 実験は6週齢のマウスで行われ、すべてのマウスは3日以内に年齢一致した。 マウスは、20-22℃の周囲温度と50±5％の相対湿度で12：12時間の光の下で収容しながら、標準的な市販の食事を与えられた：特定の病原体フリー施設で暗サイクル。 すべての動物研究は、Wonkwang University School of MedicineのAnimal Care and Use Committeeによって承認されました。
Luciferase reporter assay
細胞をトランスフェクション試薬Lipofectamine2000を用いてnf-κ b luciferase reporterプラスミドで一過性にトランスフェクションした。 インキュベーションの36時間後、細胞は中和サイトカイン抗体の存在下で12時間シスプラチンで処理した。 次いで、細胞をＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、続いて、レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で溶解した。 次いで、溶解物の２ ０μ ｌのアリコートを１ ０ ０μ ｌのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、その後、発光された光強度を、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏｌｕｍａｔ ＬＢ９ ５ ３（例えば、Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｂａｄ Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。 最後に、ルシフェラーゼ活性を三重に測定し、平均化し、次いで、ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ，Ｔｒｏｐｉｘ Ｉｎｃ．、MA、米国）製造業者の指示に従って。＜３ ３ ６ ９＞＜２ ３ ２ ２＞ｓｉＲＮＡ構築物を用いたトランスフェクション＜６ ４ ７ ９＞＜３ ２ ５ ７＞マウスＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ６、および対照スクランブルｓｉＲＮＡに対する予め設計されたｓｉＲＮＡを、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。 STAT4およびSTAT6に対するsirnaのセンス鎖は以下の通りである。 ＳＴＡＴ４ｓｉＲＮＡ構築物は、以下の３つのｓｉＲＮＡ配列のプールである：二重鎖１センス鎖：５’−Ｉｎｄｅｘｔｅｒｍｇｕａ ＧＣＵ ＧＵＧ ＧＵＡ ＡＵＵ ＵＣＡ Ａ−３’、二重鎖２センス鎖：５’−Ｉｎｄｅｘｔｅｒｍｃｕａ ＣＣＵ ＵＣＣ ＵＧＡ ＵＣＵ ＡＣＡ Ａ−３’、および二重鎖３センス鎖：５’−Ｉｎｄｅｘｔｅｒｍｃｕｇ ＵＣＧ ＵＧＡ ＵＧＡ ＵＵＵ ＣＵＡ Ａ−３’（ｍＲＮＡ ＳＴＡＴ６ｓｉＲＮＡ構築物は、以下の３つのｓｉＲＮＡ配列のプールである：二重鎖１センス鎖：５’−Ｉｎｄｅｘｔｅｒｍｇａｕ ＧＣＵ ＵＵＣ ＵＧＵ ＵＡＣ ＡＡＣ Ａ−３’、二重鎖２センス鎖：５’−Ｉｎｄｅｘｔｅｒｍｃｕａ ＧＣＣ ＵＵＣ ＵＣＣ ＵＣＡ ＡＵＧ Ａ−３’、及び二重鎖３センス鎖：５’−Ｉｎｄｅｘｔｅｒｍｇｕｃ ＵＣＵ ＡＣＵ ＡＵＣ ＡＡＧ Ａ−３’（ｍＲＮＡアクセ 細胞を、製造業者のプロトコルに従って、Ｘ−Ｔｒｅｍｅｇｅｎｅ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｎｚｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中の１ ０ ０ｎＭのｓｉＲＮＡ構築物で一過性にトランスフェクトした。 33℃および5％CO2で36時間インキュベーションした後、細胞をさらにシスプラチンで24時間処理した。 発現の干渉は、イムノブロット分析によって確認された。
ELISAによる炎症性サイトカインの測定
シスプラチン処理細胞からの炎症性サイトカインの分泌を測定するために、培養上清を各時点で採取し、分泌された炎症性サイトカインのレベルをELISA(Quantikine Cytokine Kits)によって測定した。; R&株式会社ディーシステムズ）製造業者の指示に従って。細胞ペレットを、溶解緩衝液（10mM HEPES、pH7.9、1.5mM Mgcl2、10mM KCl、0.5mMフェニルメチルスルホニルフッ化物、および0.5mMフェニルメチルスルホニルフッdithiothreitol）を氷上で15分間インキュベートした。 インキュベーションの終わりに、１ ０μ ｌの１ ０％ＮＰ−４ ０を添加し、チューブを１ ０秒間ボルテックスした。 １ ３ ０ ０ ０×ｇで４℃で１分間遠心分離した後、上清（細胞質抽出物）を回収し、−８ ０℃で保存したが、ペレットをさらに処理して核抽出物を得た。 次いで、ペレットを抽出緩衝液（5mM HEPES、pH7.9、1.5mM Mgcl2、0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride、0.2mM EDTA、0.5mM dithiothreitolおよび25％（vol/vol）グリセロール）中に再懸濁し、4℃で30分間インキュベートした。 次いで、上清を除去し、ウェスタンブロット分析に使用するまで−８ ０℃で保存した。 最後に，蛋白質濃度をＬｏｗｒｙ法により決定した。
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析は以下のように行った。 簡単に説明すると、細胞を回収し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。 総および核/細胞質分画された溶解物は、その後、12％SDS-ポリアクリルアミドゲル上で3時間20mAで電気泳動に供し、その後、それらをニトロセルロースに移した。 次いで、膜を5%(wt/vol)乾燥乳タンパク質中で0.05%(vol/vol)Tween-20(PBS-T)を含むPBS中で1時間インキュベートし、その後、PBS-Tで洗浄し、さらに一次抗体(1:1 000)と1時間反応させた。製造業者の説明書（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；ＰＩＥＲＣＥ、ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）に従って化学発光試薬を使用する。
シスプラチン耳毒性のin vivo実験
すべてのマウスをランダムに六つのマウスの二つのグループに分けた。 対照群とみなされたグループ1動物は、PBSの腹腔内注射を受けた。 グループ2動物は、4日間連続して腹腔内注射によってシスプラチン（4mg/kg体重）を投与した。 動物は、その後、右耳の側頭骨を除去した後、最終的なシスプラチン注射の翌日にCO2ガスを使用して麻酔下で死亡しました。
ABRの測定
聴覚閾値のさらなる分析のために、ABRはシスプラチンの最終治療の前および24時間後に測定された。 次に、治療前と治療後の間のＡＢＲ閾値の変化を比較した。 マウスは、ケタミン（40mg/kg）とキシラジン（10mg/kg）のカクテルを使用して麻酔し、ABR記録中に加熱パッドで暖かく保った。 頂点に皮下（活性）針電極を挿入し，反対耳の羽状部の下のゆるい皮膚にグランド電極と基準電極を皮下に挿入した。 テスト刺激は、4、8、16、および32kHzの周波数で交互の位相トーンバーストで構成されていました。 Ｔｕｃｋｅｒ Ｄａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＴＤＴ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ，ＵＳＡ）Ｓｉｇｇｅｎソフトウェアを使用して信号を生成した。 各トーンバースト（1msの持続時間）はブラックマンウィンドウを介してゲートされ、プラトーなしで0.5msの立ち上がり-立ち下がり時間を持っていた。 刺激は、各試験セッションの前に、動物の頭部レベルに配置されたマイクでスピーカーの出力を記録することによって較正された。 ABR波形は、試験された各周波数で300トーンバーストに応答して平均化された。 各周波数で、信号の振幅は、ABR波が100-3 000Hzのフィルタ設定で記録されたトレースで消失するまで、10dB SPLから90dBステップで自動的に減衰されました。 しきい値の判定は，ＡＢＲ記録に基づいて二つの独立した実験的に盲目のオブザーバーによってオフラインにした。
コルチ外植片の器官の表面調製
すべてのマウスは、最終的なシスプラチン注射の翌日に死亡した。 側頭骨を解剖し、4％パラホルムアルデヒドに16時間4℃で固定し、0.1M PBSですすいだ。 側頭骨はさらにPBS中の10％EDTAで3日間脱灰された。 蝸牛は慎重に解剖された。 次に，血管条とらせん靭帯を切開し，コルチ臓器を残した。 蝸牛の中間回転を、ＰＢＳ中のＴＲＩＴＣ標識ファロイジン（Ｓｉｇｍａ Ｐ１ ９ ５ １、１：１ ０ ０）に２ ０分間浸漬した。 ＰＢＳで３回洗浄した後、試料を、ＴＲＩＴＣ用の適切なフィルター（励起：５ １ ０〜５ ５ ０ｎｍ、発光：５ ９ ０ｎｍ）を用いて蛍光顕微鏡下で調べた。
免疫組織化学染色およびTUNELアッセイ
除去された側頭骨を4％パラホルムアルデヒドに16時間固定し、PBS中の10％EDTAで2週間脱灰した後、脱水し、パラフィンワ 5μ mのセクションは、キシレン中で脱脂し、エタノールの段階的な濃度を介して再水和した。 免疫組織化学研究のために、免疫組織化学キット（ＤＡＫＯ ＬＳＡＢ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋ６ ８ ０，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を使用し、製造業者の指示に従って手順を実施した。 次いで、内因性ペルオキシダーゼを、室温（Ｒ Ｔ）で５分間、３％過酸化水素で遮断した。 切片をPBSで洗浄した後、非特異的結合を1％ウシ血清アルブミンで1時間ブロックした。 最後に、切片を、新たに調製した基質溶液(3mgの3-アミノ-9-エチルカルバゾール、10mlの酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.9)、500μ lのジメチルホルムアミド、0.03％過酸化水素)中で5分間染色した。 次に、免疫染色細胞の核を、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ Ｏ．). アポトーシス細胞を、ＴＵＮＥＬアッセイ（ＴＵＮＥＬ ＰＯＤ ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してｉｎ ｓｉｔｕで検出した。 簡単に言えば、セクションはdeparaffinized、再水和されました。 20μ g/mlのプロテイナーゼK(Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany)とインキュベーションした後、室温で2%H2O2中のサンプルを室温で30分間インキュベートすることによって内因性ペルオキシダーゼをブロックした。次に、組織切片をPBSで洗浄し、標識溶液で1時間37℃でインキュベートした。核をヨウ化プロピジウム(0.5μ g/ml,Molecular Probes)で室温で10分間カウンター stainedした。PBSで洗浄した後、試料を蛍光顕微鏡で調べた。＜3369＞＜2322＞逆転写酵素-PCR増幅＜6479＞＜3257＞蝸牛PCRでは、左耳側頭骨を迅速に回収し、RNAlaterに浸漬した（Ambion,Inc. 次いで、全蝸牛を解剖し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコールに従って使用することによって全ＲＮＡを抽出するために使用した。 Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した後、全ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。 次に、Taq DNAポリメラーゼ（タカラ、宝酒造、日本）を用いたPCRを、95℃で40秒、58℃で40秒、72℃で50秒の30サイクルに供し、PCR産物を1.2％アガロースゲル上で分離し、UV光下で可視化した。 ＰＣＲ増幅に使用したプライマーの配列は以下の通りであった。: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT ＧＡＡ−３’、逆、５’−インデックスＴｅｒｍｇｃａ ＧＣＧ ＡＣＴ ＣＣＴ ＴＴＴ ＣＣＧ ＣＴＴ ＣＣＴ−３’）。
統計分析
各実験は少なくとも3回実施され、報告されたすべての値は3回の分析の平均±SDを表しています。 統計的多変量解析を、ＳＰＳＳ１ １（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）統計ソフトウェアを使用して、分散分析およびＤｕｎｃａｎ検定によって行った。 結果の有意性を決定するために、双方向Ａ ＮＯＶＡおよび／または一方向Ａ ＮＯＶＡを使用した。 統計結果は、修士レベルの生物統計学者によってレビューされた。 P<0の値。05は統計的に有意であると考えられた。