クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの高度に保存された領域での単一変異は、高温でClostridium thermocellumによってセルロースから直接酢酸イソブチル産生を可能にする|Biotechnology for Biofuels

細菌株およびプラスミド

本研究で使用される細菌株およびプラスミドは、Clostridium thermocellumによってセルロースから直接酢酸イソブチル産生を可能にする。表2. Clostridium thermocellum DSM1313≤hpt(M1354)株は、高温でのエステル生産のためのホストとして使用されました。野生型DSM1313におけるヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（hpt、Clo1313_2927）の欠失は、8-azahypoxanthine（8-AZH）カウンター選択による遺伝子工学を可能にすることに留意すべきであり、この欠失は、細胞の成長および代謝に既知の悪影響を及ぼさない。Ｃａｔｓａを含有するプラスミドｐｎｗ３３ｎは熱安定性であり、Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ中で種々のネコを発現するために使用された。Ｐｅｔプラスミドを大腸菌における分子クローニングと酵素発現に用いた。

表2この研究で使用されたプラスミドおよび株

化学物質および試薬

他に明記されていない限り、化学物質はすべてSigma-Aldrich(MO,USA)および/またはThermo Fisher Scientific(MA,USA)から購入した。分子クローニングのために、制限酵素およびＴ４リガーゼを、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（ＭＡ、ＵＳＡ）から入手した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にはｐｈｕｓｉｏｎホットスタートＩＩＤＮＡポリメラーゼを用いた。

培地および培養

分子クローニングおよびタンパク質発現のために、特に断りのない限り、大腸菌株を適切な抗生物質を含むlysogeny broth(LB)で増殖させた。大腸菌におけるCATSaのin vivoでの特性評価のために、20g/LグルコースとM9ハイブリッド培地を使用しました。Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ培養のために、ＭＴＣ最小培地またはＣｔｆｕｄ−ＮＹ培地を、実験で指定されたように使用した。光学密度（ＯＤ）を、６００ｎｍ波長（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ２００＋，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）で分光光度計によって測定した。

多重配列アライメント解析

多重配列アライメント（MSA）解析は、MEGA7を用いて行われました。タンパク質配列をClustalWによって整列させ、ESPript3.0(http://espript.ibcp.fr)によって可視化した。 3U9F、4CLA、および2XATのタンパク質構造の主要な機能は、それぞれ、CAT_SALTI、CAT3_ECOLIX、およびCAT4_PSEAEから抽出されました。

分子モデリングとドッキングシミュレーション

三次元（3D）構造

関心のあるCATSaとアルコールの3D構造は、それぞれSWISS-ModelとMOE（Molecular Operating Environment software、version2019.01）の”Builder”ツールを使用して最初に生成された。イソブタノール-Ｃａｔｓａ錯体からイソブタノールを抽出し，それをアセチル-Ｃｏａ–Ｃａｔｓａ錯体に添加することにより，二重基質有界Ｃａｔｓａ錯体（すなわちアセチル–Ｃｏａ–イソブタノール-Ｃａｔｓａ）の三次元構造を得た。すべての構造はデフォルト変数のMOEの’QuickPrep’用具によって準備され、Amber10とのエネルギー最小化によって更に最大限に活用された:EHTの力分野。

ドッキングシミュレーション

ドッキングシミュレーションを行うために、MOEの”サイトファインダー”ツールを使用して潜在的な結合ポケットを検索しました。報告された触媒部位と一致する最高得点部位を、さらなる研究のために選択した。ドッキングシミュレーションは前述のように行った。簡単に言えば、アセチルCoAと各アルコールは、三角形マッチャー配置法とロンドンΔ Gスコアリング関数と誘導fitプロトコルを使用してドッキングしました。ドッキングシミュレーションの後、残基と二乗平均偏差（RMSD）<2Åで基板との間の重要な相互作用を示す最高得点結合ポーズを選択しました。一例として、アセチル-CoAドッキングのために、Ser-148のヒドロキシルとCoAのN71との間の水素結合を示す結合姿勢が選択された。アルコールドッキングのために、His-189のN3とアルコールのヒドロキシルとの間の水素結合を示す結合姿勢が選択された。

in silico mutagenesis analysis

アセチル-CoA–イソブタノール–CATSa複合体のin silico mutagenesis analysisは、前述のように行った。具体的には、MOEの”アラニンスキャン”と”残基スキャン”ツールは、変異誘発のための潜在的な残基の候補を同定するために使用されました。

分子クローニング

プラスミド構築

プラスミドは、追加ファイル1：表S1に記載されているプライマーを用いて、リガーゼ依存法および/またはギブソンアセンブリの標準的な分子クローニング技術によって構築された。構築されたプラスミドは、熱ショック形質転換によって大腸菌TOP10に導入されました。選択的プレート上に単離されたコロニーをＰＣＲスクリーニングし，プラスミドを精製した。精製されたプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換される前に、Ｓａｎｇｅｒ配列決定を介して検証された。部位特異的変異誘発は、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発プロトコールを使用して、重複長の減少またはＧｉｂｓｏｎａｓｓｍｅｌｌｙｍｅｔｈｏｄを用いて実施した。 C.thermocellum工学のために、プラスミドphs005を最初に構築し、次にphs0024に修飾した。プラスミドの他の配列はphs005と同一であるが、phs0024はオペロンの下流にhptを有さない。

形質転換

大腸菌とc.thermocellumの形質転換には、それぞれ従来の化学変換とエレクトロポレーション法を使用しました。 C用。しかし、thermocellumは、ここに記載されているように、方法をわずかに変更した。まず、ｃ．ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍＭ１３５４（表２）を、ｃｔｆｕｄ−ＮＹ培地５０ｍｌ中で、嫌気性チャンバ内５０℃で培養した（Ｂａｃｔｒｏｎ３００，ＳｈｅｌｄｏｎｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＩｎｃ．、または、米国）。 0.8–1.0の範囲のODを有する細胞培養物を室温で20分間冷却した。この時点を超えて、すべてのステップがチャンバの外で実行されました。冷却された細胞を６５００×ｇおよび４℃で２０分間回収した。細胞ペレットを氷冷したＭｉｌｌｉ−Ｑ水で２回洗浄し、２５０ｍＭショ糖および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールからなる形質転換緩衝液２００μ Ｌに再懸濁した。電気competent細胞のいくつかの30μ lアリコートは、さらなる使用のために−80℃で直ちに保存された。電気穿孔のために、電気補償細胞を氷上で解凍し、500-1000ngのメチル化プラスミドと10分間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷した１−ｍＭｇａｐ電気穿孔キュベット（ＢＴＸＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）に移し、続いて２つの連続した指数減衰パルスを１とした。8kV、350Ω、および25µ F。パルスは通常7.0–8.0msの時定数をもたらした。細胞を予め温めた新鮮なＣｔｆｕｄ−ＮＹ中に直ちに再懸濁し、ゴムキャップされたＢａｌｃｈ管の中で嫌気性条件下（９０％Ｎ２、５％Ｈ２、および５％ＣＯ２）で５０℃で回収した。０〜１２時間の回収後、細胞を、１５μ ｇ／ｍｌのチアムフェニコールを添加した溶融Ｃｔｆｕｄ−ＮＹ寒天培地と混合した。最後に、培地−細胞混合物をペトリ皿上に注ぎ、嫌気性チャンバ内で固化させた。コロニーが出現するまで、プレートを50℃で1週間までインキュベートした。形質転換効率は、μ gプラスミド当たり2-100コロニー形成単位（CFU/μ gプラスミド）であった。

大腸菌におけるCATSaおよびその変異体のin vivoでの特性評価

大腸菌におけるCATSaおよびその変異体のin vivoでの特性評価のために、2g/Lの様々なアルコーエステルのｉｎｓｉｔｕ抽出のために、各チューブを２５％（ｖ／ｖ）ヘキサデカンで重ねた。Ｃａｔｓａおよびその変異体のタンパク質発現を確認するために、１％（ｖ／ｖ）のストック細胞を、５ｍｌのＬＢ培地および抗生物質を含む１５ｍｌの培養管中で３７℃および２００ｒｐｍ次いで、一晩の培養物の４％（ｖ／ｖ）を、２４ウェルのマイクロプレート中の抗生物質を含有する１ｍｌのＬＢ培地に移した。培養物を、インキュベートｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓｈａｋｅｒ（ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＯＤが０．１ｍＭイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、蒸発および交差汚染を防止するための呼吸容易密封膜で４時間使用した（ｃａｔ＃５０−５５０−３０４，ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｒｐ．，ＩＬ，ＵＳＡ）。タンパク質サンプルを、Ｂ−ＰＥＲｃｏｍｐｌｅｔｅ試薬（ｃａｔ＃８９８２２，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。

酵素特性評価

Hisタグ精製

酵素発現のために、一晩培養に1を接種した。:1mM IPTGおよび抗生物質を含有する新鮮なLB培地中で50比、続いて200rpmの振盪インキュベーター中で18℃一晩インキュベーション（最大20時間）する。誘導された細胞を、４℃での遠心分離および４７００×ｇで１０分間の遠心分離によって回収した。次いで、細胞ペレットをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ水で１回洗浄し、Ｂ−ＰＥＲｃｏｍｐｌｅｔｅ試薬に再懸濁した。室温で３０分間インキュベーションした後、混合物を１７，０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を収集し、粗抽出物として指定した。Ｈｉｓ−ｔａｇ精製のために、粗抽出物を、製造業者が推奨するように、バッチ中でＨｉｓｐｕｒＮｉ−ＮＴＡｓｕｐｅｒｆｌｏｗアガロースとインキュベートした。次いで、樹脂を、50mM Tris–HCl(pH8.0)、300mM NaCl、10mMイミダゾール、および0.1mM EDTAからなる少なくとも3容量の洗浄緩衝液で洗浄した。樹脂結合タンパク質を、50mM Tris–HCl(pH8.0)、50mM NaCl、300mMイミダゾール、および0.1mM EDTAを含む300μ Lの溶出緩衝液によって溶出した。次いで、溶出した試料を脱塩し、１０ｋＤａの分子量のカットオフを有するアミコンフィルターカラムを介して濃縮した。最後に、タンパク質試料を200μ lの20mM Tris–HCl緩衝液(pH8.0)に懸濁した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を基準蛋白質としてＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより蛋白質濃度を測定した。

熱シフトアッセイ

タンパク質融解温度（Tm）を測定するために、thermofluorアッセイはSYPRO Orangeで採用されました。約１０〜２５０μ ｇのＨｉｓ−ｔａｇ精製タンパク質を、９６ウェルｑＰＣＲプレート中の５０μ ｌの最終体積中で５×ＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅと混合した。アッセイを実行する前に、プレートをPCRキャップで密封した。Ｓｔｅｐｏｎｅｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲｍａｃｈｉｎｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、以下のパラメータ：ＲＯＸレポーター、サイクル当たり１℃増分、サイクル毎に１分保持、および２０〜９８℃の温度範囲でアッセイを実行した。

5,5′-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)アッセイ

各猫の反応速度は、384ウェルプレート内のDTNBアッセイによって決定されました。 50mM Tris–HCl(pH8.0)を含む反応緩衝液を用いて、全反応容積を50μ lとした。アセチル−Ｃｏａ（ＣｏａｌａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＴＸ，ＵＳＡ）およびアルコールの濃度は、各実験で指定されたように変化させた。 0.05μ g/mLおよび10μ g/mLの最終酵素濃度は、それぞれクロラムフェニコールおよびアルコールに対する反応に使用された。反応速度論を、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（ＳｙｎｅｒｇｙＨＴＸｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ、Ｂｉｏｔｅｋ）中で５０℃で１時間毎に４１２ｎｍでの吸光度を測定することによって収集した。反応速度は、同じ条件下での遊離補酵素Ａ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，ＯＨ，ＵＳＡ）の標準曲線からの吸光係数を使用して計算した。プレートリーダーに推奨される最大動作温度は50℃であるため、高温でのCATのハイスループット酵素アッセイは、酵素動態パラメータを決定するためにのみ行

反応速度の速度論的パラメータの計算

ミカエリス–メンテン速度則のパラメータ（Eq. 1)各酵素について以下のように計算した。最初に、マイクロプレートリーダから収集されたデータに対して線形回帰を行い、異なる初期基質濃度$s_{i}$における初期反応速度$y_{i}$を同定した（式中、i={1,2,…,n}は収集されたデータポイントの数である）。次いで、すべての複製物についてのこれらの初期反応速度および関連する初期基質濃度を、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ–Ｍｅｎｔｅｎモデルに同時に適合させた（Ｅｑ． 1)ロバスト非線形回帰の使用(Eq. 2)ソフトL1損失推定器(Eq. 3)SciPy数値計算ライブラリv1.2.0で実装されているように :

$$v_{i}=\frac{{v_{\text{max}}s_{i}}}{{K_{\text{M}}}+s_{i}}+となります。} }}$$

(1)

$$\min sum_{i=1}1{n}\rho\left({\left({v_{i}\left({s_{i},K_{\text{M}},v_{\text{max}}}\right)-y_{i}}\right)-これは、min sum_{i=1}v{n}\rho\left({v_{i}\left({s_{i},K_{\text{M}},v_{\text{max}}}\right)-を意味します。)^{{^{2} }} } \右)$$

(2)

$$\1+z}}\right）-1。$$

(3)

最小二乗問題は、モデル予測反応速度$v_{i}$と測定反応速度$y_{i}$の差を最小化することによって、パラメータ$K_{\text{M}}$と$v_{\text{max}}$を決定します。 2). 平滑化関数$\rho\left(z\right)$は、最小二乗問題を外れ値に対して耐性にするために使用されます（Eq. 3). 外れ値に対する不偏抵抗と従来の線形化法による誤差の回避により，ロバスト非線形回帰はＭｉｃｈａｅｌｉｓ-Ｍｅｎｔｅｎモデルに対して最も正確なパラメータ推定を提供する。

C.thermocellumにおける酢酸イソブチル生産

セロビオース発酵

c.thermocellum株におけるセロビオースからの酢酸イソブチル生産は、二段階の生物変換構成によって行細胞は、最初に、ODが0.8–1に達するまで、ゴムキャップされたBalch管中の5g/Lのセロビオースを含むMTC最小培地中で培養した。0. 細胞を室温で２０分間冷却し、４７００×ｇおよび４℃で２０分間遠心分離した。上清を除去した後、細胞を、嫌気性チャンバ内の２ｇ／Ｌイソブタノールを含有する同じ容積の新鮮なＭＴＣ最小培地に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、２００μ ｌのヘキサデカンオーバーレイを有する２.０ｍｌのスクリューキャップ微小遠心管中で８００μ ｌに分割した。細胞を55℃で24時間インキュベートし、続いて質量分析計（GC/MS）と結合したガスクロマトグラフィーを分析し、生成された酢酸イソブチルの量を定量した。

セルロース発酵

セルロース発酵には、変性MTC培地（C-MTC培地）を用いた。 20g/LのAvicel PH-101をセロビオースの代わりに唯一の炭素源として使用し、10g/LのMOPSを加えて緩衝容量を増加させた。最初のpHを5M KOHによって7.5に調整し、オートクレーブした。嫌気性チャンバー中で、0.8mLの一晩の細胞培養物を、15.2mLのC-MTC培地（1:20接種比）に、4mLの重ねヘキサデカンを接種した。各管はセルロースを均質化するために小さい磁気スターラー棒を含んでいた。ゴムによっておおわれるBalchの管は55°Cおよび磁気感動的なシステムで置かれる温度調節器と接続される水浴で孵化しました。 70μ lの5M KOH注入によるpH調整に続いて、800μ lの細胞培養物および200μ lのヘキサデカン層を12時間ごとにサンプリングした。培養pHは発酵中に6.4–7.8の範囲内に維持した。

ペレットタンパク質を測定することにより細胞増殖をモニターした。８００μ ｌの試料採取量からの細胞−セルロースペレットを、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で２回洗浄し、２００μ ｌの溶解緩衝液によって懸濁させた（０．２ＭＮａｏｈ、１％ＳＤＳ）に続いて室温で１時間インキュベーションした。その後、溶液を50μ lの0.8M HClで中和し、550μ lの水で希釈した。この混合物を１７，０００×ｇで３分間遠心分離した。上清からのタンパク質濃度を、洗剤適合性Ｂｒａｄｆｏｒｄａｓｓａｙ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＷＡ，ＵＳＡ）によって分析した。残留セルロースを定量する前に、残留ペレットを98℃のオーブンで1時間煮沸した。

残留セルロースをフェノール–硫酸法によりいくつかの修正を加えて定量した。煮沸した試料をミリＱ水で２回洗浄し、８００μ Ｌの水に懸濁し、元の試料と同等の体積とした。試料をピペッティングおよび10秒間vortexingによって均質化し、20μ lの均質化された試料を新しい2.0mLのマイクロ遠心管または96-wellプレートに移し、55℃のオーブンで一晩乾燥させた。乾燥したペレットを２００μ ｌの９５％硫酸中に懸濁し、室温で１時間インキュベートした。ペレットを完全に溶解した後、２０μ ｌの５％フェノールを加え、硫酸溶液と混合した。室温で30分間インキュベーションした後、100μ lの試料を新しい96ウェルプレートに移し、490nmでの吸光度を測定した。吸光度は、同じ手順で処理されたAvicel PH-101の標準曲線によってセルロース濃度に変換された。

分析方法

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)

高速液体クロマトグラフィー(Hplc)システム(島津製作所)を用いて細胞外代謝産物を定量した。、MD、米国）。培養試料800μ lを17,000×gで3分間遠心分離し、次いで、上清を0.2μ mフィルターを通して濾過し、10mNのH2SO4移動相で0.6mL/分、Aminex HPX-87H(Biorad Inc. ２２０ｎｍの屈折率検出器（ＲＩＤ）および紫外検出器（ＵＶＤ）を使用して、糖、有機酸およびアルコールの濃度を監視した。＜3721＞＜5524＞ガスクロマトグラフィーと質量分光法（GC/MS）＜2946＞＜2877＞エステルは、MS（HP5973、Agilent、CA、USA）を搭載したGC（HP6890、Agilent、CA、USA）によって測定した。 GCシステムでは、zebron ZB-5(Phenomenex,CA,USA)キャピラリーカラム(30m×0.25mm×0.25μ m)を使用して分析物を分離し、0.5mL/分の流量でヘリウムを担体として使用した。オーブン温度プログラムは、以下のように設定した：初期温度５０℃、１℃／分が５８℃まで上昇、２５℃／分が２３５℃まで上昇、５０℃／分が３００℃まで上昇、および３００℃で２分ベーＭＳシステムのために、選択されたイオンモード（ＳＩＭ）を使用して、以下のパラメータでエステルを検出および定量した：（ｉ）酢酸エチル、ｍ／ｚ４５.００および６１.００（４.２〜４.６分）保持時間（ＲＴ）、（ｉｉ）酢酸イソプロピル、ｍ／ｚ４５および１０２（４.７〜５.０分）ＲＴ、（ｉｉｉ）酢酸プロピル、ｍ／ｚ５９および７３（５.２〜５.８分）ＲＴ、（ｉｖ）イソ酪酸エチル、ｍ／ｚ４５および１０２（５.２〜５.８分）ＲＴ、（ｉｖ）酢酸エチル、ｍ／ｚ４５および１０２（５.２〜５.８分）ＲＴ、（ｉｖ）酢酸エチル、ｍ／ｚ４５および１０２（５.２〜５.８分）ＲＴ、（ｉｖ）酢酸エチル、ｍ／ｚ４５および１０２（５.２〜５.８分）ｒｔ、び１１６、（ｖ）酢酸イソブチル、ｍ／ｚ６１および１０１、（ｖｉ）酢酸ブチル、ｍ／ｚ６１および１１６、（ｖｉｉ）イソブチルイソ酪酸、ｍ／ｚ８９および１２９、１０.１〜１２である。5分RT、（viii）酢酸ベンジル、m/z108および150 13.1から13.8分RT、および（ix）2-酢酸フェネチル、m/z104および121 13.8から15.5分RT。エステルはＲＴによって同定され、ピーク面積および標準曲線によって定量された。標準曲線は、0.01g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、および1g/Lの濃度でヘキサデカンに希釈された純粋なエステルを用いて決定した。