クレミゾールおよびセロトニンシグナル伝達の調節因子は、ドラベ症候群における発作を抑制する

要約

ドラベ症候群は、早期発症発作、言語および運動発達の遅延、睡眠障害、不安様行動、重度の認知欠損および死亡リスクの増加を伴う壊滅的な小児てんかんである。 それは主に神経の電圧活動化させたナトリウムチャネルをコードするSCN1Aの遺伝子のde novoの突然変異によって引き起こされます。 SCN1A相同体の突然変異を持つゼブラフィッシュは、自発的な発作活性を再現し、Dravet症候群で観察された痙攣的行動の動きを模倣する。 ここでは、ゼブラフィッシュscn1変異体における薬物ライブラリの表現型スクリーニングが急速に成功し、新しい治療法を識別することを示してい 我々は、クレミゾールがセロトニン受容体に結合し、その抗てんかん活性は、セロトニン信号経路例えばトラゾドンとロルカセリンに作用する薬物によ これらのゼブラフィッシュ所見と一致して，臨床的に承認されたセロトニン受容体アゴニスト（lorcaserin，Belviq®）を用いて医学的に難治性のDravet症候群患者を治療し，発作頻度および/または重症度の低下に関して有望な結果を観察した。 我々の知見は、ゼブラフィッシュの前臨床発見から、ターゲット同定を通じて、Dravet症候群の潜在的な臨床治療への迅速なパスを示しています。

はじめに

壊滅的と分類される小児てんかんは、多くの場合、遺伝的変異と関連しています。 これらの中で、Ｄｒａｖｅｔ症候群は、単一遺伝子、ＳＣＮ１Ａにおける６ ０ ０以上のｄｅ ｎｏｖｏ変異に関連している（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ０；Ｅｓｃａｙｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2010). Dravet症候群に罹患している子供は、早ければ6ヶ月齢、言語および運動発達の遅延、睡眠障害、不安のような行動および重度の認知欠損を示す（Dravet、2011）。 自閉症スペクトラム障害の症状も報告されている（Li et al. この集団におけるてんかん（SUDEP）による突然の原因不明死のリスクは、他の小児てんかん（Kearney、2013）よりも15倍高いと推定されている。 利用可能な抗てんかん薬は、適切な発作制御を提供しておらず、切除神経外科的処置は一般的に選択肢ではありません。 Dravet症候群の新しい治療法は、カンナビジオール（Epidiolex（登録商標））およびstiripentol（Diacomit（登録商標））の限られた臨床試験においてある程度の有効性にもかかわらず、重要な満たされていない必要性のままであり、認知または食欲の安全性の懸念に関連する可能性がある（Perez et al., 1999; Chiron et al. ら，２ ０ ０ ０；Ｄｅｔｙｎｉｅｃｋｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ６；Ｄｅｖｉｎｓｋｙ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016).

電圧ゲートナトリウムチャネル（Nav1.1）の孔形成αサブユニットをコードする遺伝子であるSCN1Aの変異は、Dravet症候群の患者のほぼ85％で同定されている（Dravet、2011）。 １チャネルは、活動電位生成の間に見られる神経膜の高速脱分極に寄与する（Ｈｏｄｇｋｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1952). 1における機能喪失変異のためのヘテロ接合マウスは、人生の早い段階で自発的および温度感受性発作を発症し、生後25日目の周りに時期尚早に死 ら，２ ０ ０ ６；Ｏａｋｌｅｙ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ９；Ｃｈｅａｈ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2012). これらおよび関連するScn1A欠損マウスにおける急性電気生理学的研究は、ナトリウム電流密度の減少と減少シナプス阻害およびネットワーク過興奮性で最高潮に達するGABA発現抑制性ニューロン（ただし、興奮性主細胞ではない）の亜集団のための焼成活性の関連する減少を示唆している（Yu et al. ら，２ ０ ０ ６；Ｋａｌｕｍｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ７；Ｈａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2012). この”介在神経障害”仮説は、壊滅的な小児てんかんの他の形態と一致しており、Scn1Aが選択的にパルバルブミンまたはソマトスタチン発現介在神経亜集団から削除されたマウスで確認された（Dutton et al. ら、２ ０ １ ３；Ｔａｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2014). 自閉症様行動もまた、これらのマウスにおいて報告された（Ｈａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2012). 興味深いことに、Dravet症候群の二人の患者から誘導された誘導多能性幹細胞技術を用いて誘導されたヒト興奮性および抑制性ニューロンに関する初期の研究は、両方の細胞型の電圧活性化ナトリウム電流の欠損を報告し、重要な脳特異的ナトリウムチャネルの早期機能喪失に対する恒常性補償、またはこれらの患者で観察されたてんかん表現型に寄与する追加のメカニズムのいずれかを示唆している（Jiao et al. ら、２ ０ １ ３；Ｌｉｕ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2013).

マウスとヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンは、Dravet症候群の根底にある病態生理の理解に貢献していますが、これらのシステムは、これらのモデルの変動性と定量的測定の再現性のために、新しい治療法の迅速な同定には適していません。 ゼブラフィッシュは、小分子表現型ベースのスクリーンを実行するための理想的な脊椎動物モデル系である（MacRae et al.,2015),そして遺伝的操作に従順である,我々はゼブラフィッシュナトリウムチャネル変異体に私たちの努力を焦点を当てた. SCN1Aオルソログ、scn1labにおける機能喪失ミスセンス変異を保有するゼブラフィッシュ変異体は、変異誘発スクリーンで同定された（Schoonheim et al., 2010). 祖先の全ゲノムの重複のために、ゼブラフィッシュscn1lab変異体はNav1.1のためにハプロインフィクシャルであり、Scn1A+/−マウスまたはDravet症候群の患者に類 痙攣行動と短いinterictalと長い期間polyspike ictalのような電気的放電のエピソードは、早ければ3日後受精（dpf）として変異幼虫で観察され、4と7dpfの間のより堅牢な発作表現型に進行している（Baraban et al. ら、２ ０ １ ３；Ｈｏｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). 変異幼虫は時期尚早に死亡し、代謝障害を示す（Kumar et al. ら、２ ０ １ ６）、および多くの抗てんかん薬（Ａｅｄ）に耐性である（Ｄｉｎｄａｙ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2015). Dravet症候群の臨床管理と同様に、バルプロ酸塩、ベンゾジアゼピン、臭化物、stiripentol、ならびにケトゲン食で発作活性のいくつかの減衰を得ることができる（Baraban et al., 2013). Scn1lab変異ゼブラフィッシュの幼虫と二段階の表現型ベースのスクリーニング戦略を使用して、我々は今2300以上の化合物をスクリーニングしています。 クレミゾール、第一世代のヒスタミン受容体（H1）アンタゴニストは、行動および電気グラフィック発作活性の強力な阻害剤として同定された（Baraban et al., 2013). しかしながら、抗ヒスタミン薬は、小児てんかん集団においては禁忌である（Miyata et al. ら、２ ０ １ １）およびゼブラフィッシュ中のＨ１受容体類似体は、ヒトと５ ０％未満の類似性を示す（Ｐｅｉｔｓａｒｏ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2007). ここでは、クレミゾールではなく、抗ヒスタミン薬は、抗てんかん活性を発揮することを示すために前臨床ゼブラフィッシュモデルを使用しています。 リガンド結合とscn1変異ゼブラフィッシュにおける追加の標的薬物スクリーニングに基づいて、我々は二つの（トラゾドンとロルカセリン）FDA承認化合物を含む発作を抑制するのに有効であるとして、いくつかのセロトニン（5-HT）モジュレーターを同定した。 Lorcaserin(Belviq®)はDravetシンドロームの子供に情け深い使用プログラムの下で規定され、何人かの患者の減らされた捕捉の活動で起因した。 我々は、5-HTシグナル伝達の変調は、この壊滅的な小児てんかんのための新規治療介入を表すことを提案します。

材料および方法

ゼブラフィッシュの維持

発作モニタリング

5dpfで個々のゼブラフィッシュの幼虫は、胚培地を含む明確な平底96ウェルマイクロプレートの単一のウェルに配置されました。 この段階では性決定が不可能であるため、幼虫を無作為に選択した。 マイクロプレートをＤａｎｉｏｖｉｓｉｏｎ運動追跡装置の内部に配置し、室温で２ ０分間順化した。 Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＵＴ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄａｎｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を実行するＤａｎｉｏｖｉｓｉｏｎシステムを使用して、１ ０分間の記録時間の間に各ウェルについて移動プロットを得た。; 背景より暗い物体を識別するための閾値検出設定は、実験ごとに最適化された。 発作スコアリングは、ペンチレンテトラゾール誘発発作のために確立された以下の三段階スケールを用いて行われた（Baraban et al.,2005):ステージ0,ないまたは非常に少ない水泳活動;ステージI,増加,水泳活動の簡単な発作;ステージII,急速な”渦のような”旋回水泳行動;ステージIII,発作性全身クローン様 野生型の魚は、通常、ステージ0またはIで採点されます。 プロットは、移動距離（ミリメートル単位）と平均速度（毎秒ミリメートル単位）のために分析されました。 以前に報告されたように（Ｗｉｎｔｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ８；Ｂａｒａｂａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．,2013),速度の変化は、発作行動の最も敏感なアッセイでした.

電気生理学的研究のために、ゼブラフィッシュの幼虫をα-ブンガロトキシン（1mg/ml）で簡単に麻痺させ、1.2％アガロースに固定化した。 ら、２ ０ ０ ５；Ｈｏｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). 10-30分のアガロース埋め込まれたローカルフィールド電位記録セッションは、1kHzで各魚のために得られた。 ＩＺＡＰシステム（Ｈｏｎｇ ｅ ｔ ａ ｌ．、2016）は、麻痺剤の非存在下でのゼブラフィッシュの長期非侵襲的モニタリングに使用された。 このシステムは、マイクロ流体チャンバー内の複数の統合された表面電極の下にいくつかのゼブラフィッシュの幼虫を自律的に捕捉する。 scn1lab幼虫は5hのために絶えず監視された.電界電位は混合の処置および洗浄のための媒体の変更のための2-3分壊れ目を除いて1つのkHzで連続 記録されたデータをＭＡＴＬＡＢを用いてフィールドポテンシャルグラフと周波数解析に解析した。

化合物ライブラリースクリーニング

薬物スクリーニング用の化合物をSelleck Chemicalsから購入し、10mM DMSO溶液として提供しました。 Selleckのイオンチャネルリガンドライブラリ（カタログ＃L2700）、GPCR化合物ライブラリ（カタログ＃L2200）およびカスタマイズされた5-HT変調ライブラリは、スクリー ライブラリ化合物は、補足表１に記載される。 すべての薬物ライブラリー画面において、化合物をコード化し、化合物の性質に盲目であった研究者によって実験を行った。 移動行動のベースライン記録は、上記のように、胚培地中の変異体から得られた；次いで、試験化合物への溶液変化および２ ０分の平衡化期間の後に、第２の 移動研究のための化合物を胚培地に溶解し、250μ Mの濃度で試験し、最終DMSO濃度は2.5％であった。

陽性ヒット指定の基準は、(i)平均速度が≥40%の減少、および(ii)試験魚の少なくとも50%の歩行プロットにおけるステージ0またはステージI発作行動への減少であった。 移動アッセイにおいて「陽性ヒット」として分類された各試験化合物は、９ ０分間の薬物曝露後の立体顕微鏡上での直接可視化によって毒性を評価した。 毒性（または死亡率）は、試験魚の少なくとも50％において、外部刺激に応答して目に見える心拍または動きがないと定義された。 過興奮性は、試験魚の少なくとも50％において、水泳速度および/またはIII期発作活性の≥40％の増加を引き起こす化合物として定義された。 ゼブラフィッシュの独立したクラッチを用いた第二のアッセイで歩行スクリーニング法を用いて一次歩行スクリーンで同定された陽性ヒットを確認した。 その後、化合物をSigma-Aldrichとは別に購入し、ゼブラフィッシュの独立したクラッチ上で三度目の歩行スクリーニング法を用いて試験した。 しきい値以上の平均水泳速度を減少させ、三つの独立した歩行アッセイで非毒性であった薬物は、さらに電気生理学的アッセイを用いて分析した。 電気生理学の調査では、薬剤はlocomotionの試金を使用して250μ mの集中で最初に確認され、次に同じゼブラフィッシュはローカル分野の潜在的な記録を使用し すべてのスクリーニングは、コード化された化合物を用いて行われ、化合物の同一性を盲目にした研究者によって分析された。

系統解析

ヒトHTR2およびゼブラフィッシュHtr2タンパク質配列の系統解析を、PhyMLソフトウェアを用いてSH様尤度比試験パラメータ（http://www.phylogeny.fr/）の下で行った（Dereper et al., 2008). タンパク質配列は、EnsｓｅｍｂｌヒトＨＴＲ２Ａ（ENＳＴ０ ０ ０ ０ ０ ５ ４ ２ ６ ６ ４）、ＨＴＲ２Ｂ（ENＳＴ０ ０ ０ ０ ０ ２ ５ ８ ４ ０ ０）、ＨＴＲ２Ｃ（ENＳＴ０ ０ ０ ０ ０ ２ ７ ６ １ ９ ８）、およびゼブラフィッシュｈｔｒ２ａ ａ（ENSＳＤＡＲＴ０ ０ ０ ０ ０ １ ４ １ ５ ０ ２）、ｈｔｒ２ａｂ（ENSＳＤＡＲＴ０ ０ ０ ０ ０ １ ５ ０ ９ ８ ２）、ｈｔｒ２ｂ（ENＳＤＡＲＴ０ ０ ０ ０ ０ １ ５ ０ ９ ８ ２）に由来した。ensdart00000104569),HTR2CL1(ENSDART00000024191)シーケンス。

定量的リアルタイムmRNA発現解析

ゼブラフィッシュhtr2遺伝子の発現レベルは、5dpf野生型またはscn1labホモ接合変異幼虫から25頭または尾からプールされたRNAと、個々の野生型成体雄ゼブラフィッシュから解剖された脳を用いて調べた。 製造業者のプロトコールに従って、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出し、Ｄｎａｓｅ ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理した。 精製したｍＲＮＡを、オリゴ（ｄ Ｔ）２ ０の混合物と共にＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。 ゼブラフィッシュｈ ｔｒ２遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の真核生物翻訳伸長因子１α１（１ｌｉｋｅ１）（ｅｅｆ１ａ１ｌ１）の発現レベルを、Ｓｔｅｐｏｎｅｔｍ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２ ５ ０ｎＭプライマーおよび３μ ＬのｃＤＮＡを用いて、９ ６ウェルプレート上で２ ０μ ｌ容量で反応を行った。 オリゴヌクレオチド配列は、補足表2に記載されている。 データは三つの独立した実験から分析した。 データはＣｔ値として表され、Δ Ｃｔ値を決定するために使用された。

ヒト研究

ゼブラフィッシュモデルにおける化合物の同定と薬物動態の検討に成功した後、小児はコロラド小児病院（IND125307）で思いやりのある使用プロトコ 子供はBelviqの使用のために修飾®彼らはSCN1A変異またはDravet症候群の臨床診断を持っていた場合,いくつかのケースではstiripentolを含む少なくとも二つの薬を失 小児は、ベースライン時および製品の使用中に6ヶ月ごとに心電図および心エコー図を有する必要があった。 さらに、適切な成長を確実にし、追加の副作用を評価するために、3ヶ月ごとにフォローアップ訪問を行う必要がありました。 血液学的検査、肝機能検査および腎機能検査を含むように、6ヶ月ごとに検査室検査が必要であった。 Belviq®用量は就寝時に2.5mgで開始し、必要に応じて毎週徐々に増加させ、最大用量は1日2回10mgまたは0.3mg/kg/日のいずれか早い方に増加させた。

同意の放棄を含む遡及的なデータ収集について、機関審査委員会の承認を得ました。 Belviq®の使用前および使用後の年齢、発作の種類および頻度、有害事象、Belviq®の用量および併用薬物使用を含む、コロラド州小児病院の電子医療記録の遡及

統計分析

データは、特に明記されていない限り、平均値の平均±標準誤差（SEM）として表示されます。 二つのグループ間の比較のために、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いた。 分散が正規分布を持たない場合は、ノンパラメトリックMann-Whitney U検定を使用しました。 対照サンプルに対する分析のためのDunnettの多重比較検定または平均間のHolm-Sidakペアごとの多重比較のいずれかの後の一方向ANOVA。 統計的に有意であると考えられる差異は、アスタリスクで示される（*P<0.05;**P<0.01）。

結果

ゼブラフィッシュの発作行動に対するクレミゾールの影響

scn1lab変異幼虫（5dpf）をクレミゾールで30-400μ mの濃度で処理し、自動歩行追跡ソフトウェ 未処理のscn1lab変異体における250回の反復歩行制御試験に基づいて、ベースラインからの平均水泳速度≥40％（>1.5×SD）の減少は、発作行動の陽性抑制のしきい値として設定された。 クレミゾール（ 1A)は、300および400μ m(30分暴露)および100μ m(90分暴露)で抗てんかん活性を示した(図1a)。 1B);延長された露出はより高い濃度で有毒でした。 クレミゾールは、第二のゼブラフィッシュscn1変異体における自発的な発作行動を抑制することができるかどうかを決定するために、我々は歩行追跡ア III期の発作行動として同定された幼虫（例えば、全身痙攣、高速水泳活動および短時間の姿勢の喪失;Fig. 1C)は、前脳からのその後のフィールド記録において、interictal-およびictal様の成分を有する電気泳動放電を示すことが確認された(図1c)。 1D）。 S3または”推定scn1laa変異体”ゼブラフィッシュとして同定された幼虫の平均水泳速度は、兄弟対照または試験されたすべての幼虫よりも有意に高かった（図。 変異体は、ポストホックＰＣＲによってＳＣＮ１ＬＡＡホモ接合体として確認された。 我々は、以前にDravet症候群とscn1lab変異体（250μ m stiripentolと250μ mジアゼパム）だけでなく、250μ mラモトリジン（Dravet症候群の発作を悪化させることができるAED）の自発発作を抑 予想されるように、stiripentolおよびジアゼパムではなく、ラモトリジンは、scn1laa変異幼虫における発作行動を有意に抑制した。250μ mのクレミゾールもこのアッセイに有効であった（Fig. 1階）。 一緒に、これらの研究は、クレミゾールは、二つの異なるscn1変異ゼブラフィッシュ株における発作行動を抑制することができることを示しています。

抗ヒスタミン薬は小児てんかんを悪化させることが知られており、ゼブラフィッシュH1はヒトとの相同性が低いため、クレミゾール

scn1lab変異体

臨床用の有望な鉛化合物を同定するための三次スクリーニング

5-ゼブラフィッシュ幼虫におけるHT受容体発現

クレミゾールはHTR2AとHTR2Bに有意な結合親和性を有し、トラゾドンとロルカセリンの両方が5-HTシグナリングモジュレーターであるため、我々はゼブラフィッシュにおけるこれらの受容体の発現を確認しようとした。 ヒトとゼブラフィッシュHTR2受容体のタンパク質配列アラインメントは、Htr2AaとHtr2Abの両方がヒトHTR2Aと59.3％のタンパク質の同一性を示すと、ゼブラフィッシュオルトログと進化的保存を明らかにした。 5dpf野生型またはscn1lab変異幼虫の単離された頭または尾を使用してhtr2発現レベルの定量は、頭の中で濃縮htr2aとhtr2cl1発現を明らかにした。 変異幼虫は成体まで生存しないので、同様の結果が成体野生型ゼブラフィッシュ脳から得られた（補足図１）。 4).

Dravet症候群の患者における発作頻度の減少

Dravet症候群は、難治性てんかん、重度の認知発達およびSUDEPのリスクを含む衰弱する転帰を伴う壊滅的な小児 我々の前臨床データは、5-HTシグナル伝達の変調はSCN1A機能喪失変異に関連付けられている発作を抑制することができることの確認を提供します。 同定された5-HT調節剤は、既知の安全性プロファイルを有するFDA承認化合物であるため、これらの再利用された薬物による治療は、Dravet症候群の小児の発作頻度を変える可能性がある。 この翻訳アプローチは、大規模な臨床試験が実行可能ではない希少で壊滅的な疾患を標的とする（Dunoyer,2011;Parker et al., 2013).

クレミゾールは現在製造されておらず、臨床グレードの製剤では入手できず、トラゾドンは濃度に応じて5-ht受容体アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる（Maj et al. ら、１ ９ ７ ９；Ｍａｒｃｏｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ．,1998),我々は、Dravet症候群の子供の小さな集団における思いやりのある使用オフラベルプログラムの下でBelviq®(lorcaserin)を評価することを選択しました. これらの子供たちは、少なくとも5つの承認されたAedに耐性があることが示されました。 SCN1Aにおける欠失のためのヘテロ接合体は、Belviq®で前向きに治療され、コロラド州小児病院（Aurora、CO）で縦方向に続いた。 治療プロトコルはコロラド州医療機関レビュー委員会（COMIRB）によって承認され、Dravet症候群患者の両親は子供の参加に書面で同意しました。 我々は遡及的に無緊張、ミオクロニックおよび一般化強直間代（GTC）発作、副作用および同時Aedの日記報告数をレビューしました。

Belviq®で治療したDravet症候群の小児の臨床的特徴を表1にまとめた。 Belviq®治療された患者の間で死亡はなく、Belviq®は治療の中止を引き起こす重篤な有害事象なしに十分に耐容された。 オフラベルBelviq®治療中、一人の患者は最初に3週間発作フリーであり、一人の患者は2週間発作フリーであり、第三の患者は週に1-2発作フリー日を有していた。 すべての患者は発作の総数の減少を示した。 一般化された強直間代発作は、患者1、2および3で有意に減少した。 実際、患者2は、救助薬を必要とせずに、一般化された強直間代性発作の90％の減少を経験した。 二人の患者は、発作頻度の増加なしにBelviq®に残り、予想されるように、注目された最も一般的な副作用は食欲の減少であった。 ある患者は、短期間の暫定的な改善で二度目の投薬を再開し、その後テーパーオフした。

ディスカッション

クレミゾール、1950年代に発見された第一世代の抗ヒスタミン薬（Zierz et al. ら、１ ９ ５ ２）は、ＳＣＮ１Ｌａｂ変異体ゼブラフィッシュを使用して再利用された薬物ライブラリーをスクリーニングするためのＤｒａｖｅｔ症候群の治療のための潜在的な治療 ら、２ ０ １ ３；Ｄｉｎｄａｙ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2015). ここでは、第二scn1ゼブラフィッシュ変異体モデルを使用してクレミゾールの抗てんかん活性を確認しました。 残念なことに、クレミゾールは、血漿半減期が＜９ １ ９ ４＞１ ０分（ヒトでは３.４時間と比較して）のマウスで急速に代謝される（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅ ｔ ａ ｌ．、2013）、マウスモデルにおけるその評価を制限する。 抗ヒスタミン薬として首尾よく使用されています（Zierz et al. ら、１ ９ ５ ２；Ｊａｃｑｕｅｓ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、１ ９ ６ ０）、急性および慢性の研究では低い毒性が報告されている（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ ｅ ｔ ａ ｌ．，１ ９ ６ ０）。 ら、１ ９ ６ ０）、ｃｌｅｍｉｚｏｌｅはもはや製造されておらず、オフラベル臨床投与のために現在利用可能ではない。 効率的に前臨床げっ歯類モデルでクレミゾールを評価するための手段を欠いている、我々は標的婚約（5-HT受容体）と臨床応用への迅速な翻訳を促進する適切な安全性プロファイルと関連する薬物（トラゾドンとロルカセリン）の同定のためにゼブラフィッシュを使用しました。 医学的に難治性のＤｒａｖｅｔ症候群患者に対するｂｅｌｖｉｑ（ロルカセリン）の思いやりのある使用，オフラベル処方についても述べた。

抗ヒスタミンH1受容体拮抗薬は、通常、小児患者集団では禁忌である(Miyata et al.、2011）およびこれらの薬物をスクリーニングすることにより、scn1ゼブラフィッシュにおける発作を抑制する（場合によっては悪化させる）ことができないことが確認された。 結合データは、HTR2Aおよび/またはHTR2B受容体のための以前に未知のクレミゾール親和性を明らかにした。 標的ライブラリのその後の表現型スクリーンは、クレミゾールに匹敵する方法で行動および電気生理学的発作を抑制することができる二つの5-HT調節化合物、トラゾドンとロルカセリンを同定した。 Ｂｅｌｖｉｑ（登録商標）（ｌｏｒｃａｓｅｒｉｎ）は、慢性体重管理のために処方されたＦＤＡ承認のＨＴＲ２Ｃアゴニストである（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2008). Desyrel®（トラゾドン）はまた、一般的に睡眠障害のために処方されるFDA承認の抗うつ薬である（Mendelson、2005）。 それは頻繁にHTR2AおよびHTR2C逆アンタゴニストおよび5-HT取り込み阻害剤として分類される（Stahl、2009）。 しかし、ラットでの研究では、トラゾドン、またはその代謝産物のメタ-クロロフェニルピペラジン（mCPP）が、より高い濃度でHTR2Cアゴニストとして作用し得る ら、１ ９ ７ ９；Ｍａｒｃｏｌｉ ｅ ｔ ａ ｌ．, 1998). 特に、慢性トラゾドン治療は、マウスにおける電気けいれん誘発発作に対して防御的であることが以前に示されていた（Ｃｈａｖａｎ ｅ ｔ ａ ｌ． 2010年Borowicz et al.,2012),scn1lab変異体ゼブラフィッシュからの我々のデータをサポートしています. クレミゾールに対する5-HT受容体媒介作用は、セロトニン作動性シグナル伝達の調節因子（クレミゾールを含む）がマチャド-ジョセフ病の前臨床モデルにおいて有効な治療法であることが示された最近の表現型スクリーンと一致している（Teixeira-Castro et al. ら、2015）；およびここでの研究は、クレミゾールおよびトラゾドンが、Dravet症候群の患者におけるオフラベル試験のさらなる開発を保証することを示唆している。

我々の結果はまた、特にDravet症候群のような壊滅的な小児てんかんにおいて、発作活性の強力な抑制剤としてセロトニン作動性シグナル伝達の変調を示唆する証拠の増加に加えている。 最近、5-HT再取り込み遮断薬フェンフルラミンによる低用量治療を受けている10人の患者のうち7人が、1年間発作がないと自己報告された（Ceulemans et al., 2016). フェンフルラミンの使用と肺高血圧症との間の可能な関係と一致するこれらの患者のうちの二つにおいて、一つまたは二つの心臓弁のわずかな肥厚が報告された（Douglas et al. ら、１ ９ ８ １；Ｃｅｕｌｅｍａｎｓ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2016). ヒトでは、ＨＴＲ２ＡおよびＨＴＲ２ＣはＣＮＳで発現され、一方、ＨＴＲ２Ｂ発現は心臓で富化される（Ｌａｍｂｅ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ １；Ｍｅｌｔｚｅｒ ｅ ｔ ａ ｌ．, 2013). より具体的には、ＨＴＲ２Ｃは、阻害性介在ニューロンの亜集団上で発現される（Ｌｉｕ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ ０ ７）および５−Ｈ Ｔによるこれらの受容体の活性化は、ＧＡＢＡ媒介性シナプス阻害を増加させる（Ｂｏｏｔｈｍａｎ ｅ ｔ ａ ｌ．,2006)すなわち、多くの一般的に処方されている抗てんかん薬の根底にある抗てんかん作用機序。 実際、ほとんどの前臨床研究では、ＨＴＲ２Ａおよび／またはＨＴＲ２Ｃ受容体の活性化が抗てんかん作用を有することが示唆されている（Ｇｈａｒｅｄａｇｈｉ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ４；Ｇｕｉａｒｄ ｅ ｔ ａ ｌ． ら、２ ０ １ ５）、これは、クレミゾール、ロルカセリン、トラゾドン、および５−Ｈ Ｔ再取り込み遮断薬フェンフルラミンを連結する合理的な作用機序である（Ｄｉｎｄａｙ ｅ ｔ ａ ｌ． ら，２ ０ １ ５；Ｃｅｕｌｅｍａｎｓら，２ ０ １ ５；Ｃｅｕｌｅｍａｎｓら，, 2016). 興味深いことに、ゼブラフィッシュの脳におけるhtr2bの発現は、さらにこれらの薬物は、潜在的にHTR2AまたはHTR2C受容体活性化を介して抗てんかん活性を発揮することを示唆し、比較的低かった。 興味深いことに、パラナトリウムチャネル遺伝子におけるK1270T SCN1Aヒト変異を運ぶショウジョウバエノックインバエの研究は、5-ht前駆体（5-hydroxytryptophan）との補充が熱誘発発作表現型を救助することを示している（Schutte et al., 2014). さらに、scn1lab変異体を用いた最近の研究では、13の5-HTシグナル伝達化合物を評価し、また、5-HTシグナル伝達の調節因子の潜在的な抗てんかん役割を示唆した（Sourbron et al., 2016). しかし、これらの後者のゼブラフィッシュの研究は、基本的に異なるプロトコル（24時間対30-90分の薬物暴露）を使用し、以前に正常にドラベ症候群（ベンゾジアゼピン、バルプロ酸、スチペントール、臭化物、およびケトン食）で使用されるAedを識別するように検証されていない。 さらに、薬剤濃度は、本発明者らがゼブラフィッシュにおいて有効であることを実証するよりも約１ ０倍低い（Baraban et al. ら，２ ０ ０ ５，２ ０ １ ３；Ｄｉｎｄａｙら，２ ０ ０ ５，２ ０ １ ３． ら、２ ０ １ ５）、および幻覚剤ＴＣＢ−２に対する抗てんかん作用を報告している（図１ ４Ａ）。 5)は、異なったプロシージャを使用して実験室からのデータの直接比較が慎重に解釈されるべきであることを提案します。

全体的に、我々は、変異ゼブラフィッシュは、適切な安全性プロファイルで、直接そのようなDravet症候群などのリスクのある患者集団のための臨床ケア

略語

略語
• 5-ht

  セロトニン

• AED

  抗てんかん薬

• dpf

  受精後の日数

• GPCR

  Gタンパク質共役受容体

• iZAP

  統合ゼブラフィッシュ解析プラットフォーム

謝辞

私たちは、バラバン研究所のメンバー、特にBrian GroneとMatthew Dindayに役立ちましたことに感謝したいと思います これらの研究の過程での議論。

資金調達

S.C.BはNINDS R01grant noからの資金調達を認めている。 NS079214、UCSF触媒賞とレイモンド&ビヴァリーサックラーセンターサバティカル基金。

補足資料

補足資料はBrain onlineで入手できます。

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