キメラ

あなたが提供するものパートI

• 口座番号。
• 40本の染色体を持つマイコプラズマを含まないES細胞株。

私たちがすること

• ES細胞株あたり約50個の胚盤胞を注入します。 これは生まれた10匹のマウスで起因するはずです。 マウスのうちの3つは強い雄キメラであると予想されている。 私達に成功の証明された記録があります。
• 離乳まで（生後三週間）マウスを飼育します。

あなたが提供するものパートII

• あなたは離乳マウスを収容します。

コスト

• 129細胞株あたり3,300ドルとドナー女性のコスト;他の遺伝的背景のための細胞株あたり4,950ドルとドナー女性のコスト。
• Cwru以外の現地での注文には、マウスの梱包と輸送に200ドルの追加料金が課金されます。 現地以外の注文にはtransportation200と輸送費が請求されます。

規制遵守

• 研究者は、コアからマウスを受け取るために、彼らの機関からIACUCプロトコルを必要としています。 CWRU IACUCプロトコルは、ケーストランスジェニックコアの使用を指定する必要があります。 動物における組換えDNAのレビューは、トランスジェニックコアのオンライン注文を通じて提出された情報について行われ、承認された場合は修正としてコアのIBCプロトコルに追加される。 お客様は、注文の提出後にrDNAレビューの一環として、IBCから追加情報について連絡を受けることができます。 Ibcの承認は注入の開始前に要求されます。

謝辞

• セミナーや出版物において、トランスジェニックおよびターゲティング施設の場合をご了承ください。

タイムライン

• 細胞の注射日から、マウスをお届けできるまでに最低6週間（妊娠の場合はほぼ3週間、離乳の場合は少なくとも出生後の成長の3週間）になります。 男性のキメラが繁殖するのに十分な年齢になるまでにはさらに6週間、生殖系列の伝達をテストするために子孫を遺伝子型に離乳させる前には、合計4週間になります。注入からの生殖ライン伝達のためのテストへの5か月。
• 現在（3/25/21）の発注からES細胞注入までの予想時間は8週間です。 注射前の８週間の間に、キメラ要求は、ＩＢＣのｒＤＮＡ委員会によって検討され、ＥＳ細胞は解凍され、増殖され、そしてマウスは、注文され、そして受け取られる。

キメラマウスを生成する成功率

コアは、細胞株あたり約5キメラの平均を生成します。

はじめに
標的変異の生殖系列伝達の可能性は、利用可能な独立したES細胞株の数とともに増加する。 平均して、129の遺伝的背景にあるES細胞株の約3分の2から4分の3は生殖系列になります。 C57背景のES細胞株では、平均して2分の1から3分の2の株が生殖系列になります。 したがって、公開リポジトリからターゲットES細胞株を購入する場合は、129の背景に3つ以上の正確なターゲットラインを購入し、C57の背景に4つ以上の行を購入することをお勧めします。 同様に、129行に対して2回以上の注入を注文し、C57行に対して3回以上を注文します。 EUCOMMからのES細胞の条件付き対立遺伝子を持つ組織特異的ノックアウトの生成については、私たちのプライマーを参照してください。

よくある質問

キメラとは何ですか？
典型的には、キメラは、遺伝子標的または遺伝子捕捉されたES細胞株からマウスを生成するために構築される。 宿主胚に注入されたES細胞は、キメラとして知られているモザイクマウスを生じさせる。
雄のES細胞を未成熟胚盤胞に注入する。 宿主胚が雌であり、雄のES細胞が生殖細胞を作る場合、キメラはしばしば肥沃な雄である。 ES細胞とあまり強く競合しない株からの宿主胚を使用し、二つの成分（ESと宿主胚）は、動物へのES細胞の寄与を容易に決定することができるように、毛色遺伝子で遺伝的にマークされている。 動物のコート中のES細胞子孫の割合が高い場合、ES細胞は胚発生の初期に宿主細胞と完全に混合するので、es細胞が配偶子に表される確率も高い。 コートカラー-マーキングシステムはまた、キメラの子孫がES細胞成分または宿主胚成分からのものであるかどうかを、適切な交雑で決定することを可能に
129ES細胞はa/a（野生型Agouti）であるために茶色のコート色を生じさせ、C57BL/6J宿主胚はa/a（劣性nonagouti）であるために黒色のコート色を生じさせる。 ＥＳ細胞はマウスの１ ２ ９株由来であり；宿主胚はマウスのＣ５ ７ＢＬ／６Ｊ株由来である。 これらのキメラをa/a非agoutiマウス（例えば、C57BL/6J）に飼育する場合、褐色の子孫（A/a）はES細胞由来の配偶子から生じている必要があり、褐色の子孫の50％がノックアウト対立遺伝子を有すると予想される。 あるいは、突然変異の伝達は、子孫からの組織のＰＣＲまたはサザンブロットアッセイによって直接アッセイすることができる。＜２ ９ ８ ４＞ＥＳ細胞がＣ５ ７ＢＬ／６Ｊ株（ａ／ａ、Ｔｙｒ／Ｔｙｒおよび黒色）由来のものである場合、宿主胚はアルビノＣ５ ７ＢＬ／６Ｊ（Ａ／ａ、Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｔｙｒｃ２−Ｊおよび白色）である。 このようなキメラをアルビノＣ５ ７ＢＬ／６Ｊに繁殖させることは、ｅｓ細胞成分から黒色の子孫（ａ／ａ、Ｔｙｒ／Ｔｙｒｃ−２Ｊ）を生成することができ、その５ ０％が突然変異を有す
標的変異を伝達する可能性のある男性キメラは、交尾プラグジェノタイピングによって同定することができる。

その他の用途のキメラ
凝集キメラや二倍体二倍体キメラも作製しています。 マウスの二つの異なる株からの二つの着床前胚は、凝集キメラを形成するために組み合わされます。 この技術は、自律性および遺伝子作用および他の実験目標の非自律性の分析のための遺伝的モザイク胚を生成するために使用することができる。 二倍体テトラ倍体キメラでは，四倍体成分は主にはい由来胎盤の多くを生じ，二倍体成分ははいに生じる。 このタイプのキメラは、遺伝子が胎盤または胚に必要とされるかどうかを決定するために使用することができる。

なぜ私のマウスは面白い色ですか？
いくつかのES細胞株は、後の世代でのみ自分自身を明らかにするコートカラー対立遺伝子のヘテロ接合性である。 我々が使用するR1 129ES細胞は、アルビノ遺伝子座でヘテロ接合であり、アルビノのチンチラ対立遺伝子（cch、またTyrc-chと命名）の一つのコピーを運び、ピンク目の希釈座（p）でヘテロ接合である。 R1ES細胞から互いに子孫を繁殖させることは、コートカラー対立遺伝子の品揃えに応じて、黒、灰色の異なる色合い、茶色の異なる色合い、または黄色のマ

生殖系列の伝達を確実にするために何ができるのでしょうか？
生殖系列の伝達は、培養に最小限の時間を費やし、染色体の正常な補体を有し、酵母、細菌およびマイコプラズマを含まないES細胞で最大化される。 ターゲットあなたが知っている細胞株は、あなたの教育機関であなたの条件の下で送信されます。 利用可能な最も低い継代番号（好ましくは継代番号１ ６未満）にある親細胞株を使用する。 目標とされたラインが培養される時間を最小にして下さい。 標的化された細胞株が正常な数の染色体を有することを確認する。 マイコプラズマのためにあなたの細胞株をテストします。 いくつかの細胞株は、これらのすべてのパラメータがあなたの好意にある場合でも送信されません。 最適な条件下であっても、標的とされたES細胞株の3分の2のみが生殖細胞株を介して伝達されるであろう。 従って、伝達を保障するために少なくとも3つの独立した目標とされた細胞ラインから始めて下さい。

私は弱いキメラ/女性キメラを持っています。 彼らはノックアウトを送信しますか？
弱いキメラと雌のキメラの両方が、まれではあるが、変異対立遺伝子を伝達することができる。 標的突然変異を伝達する可能性のある雄キメラは、交尾プラグ遺伝子型決定によって同定することができる。 女性キメラの約10％のみがES細胞ゲノムを伝達し、そうすると最初のいくつかの同族にのみ存在し、その男性の子孫の多くは性染色体異数性を有し、そ ら、１ ９ ９ ５ＰＮＡＳ９ ２，３ １ ２ ０）。

なぜ私の最強のキメラは死んだのですか？
死亡率は、最良の細胞株であっても、ES細胞由来の動物の割合とともに増加する可能性がある。 この死亡率は、主に文化の中で生じたエピジェネティックな異常によるものです。 エピジェネティック異常は、生き残ったマウスのその後の繁殖によって修正されると考えられており、そうでなくても、標的遺伝子座からランダムに分離される。

変異体をどのようなマウスに繁殖させるのですか？
遺伝的変動をできるだけ早く最小限に抑えるために、キメラをES細胞と同じ背景に繁殖させる。 ES細胞が129であった場合、キメラを129マウスに繁殖させると、あなたの突然変異は1ステップで129近交系の背景に完全になります。 遺伝学的研究のための最も一般的な近交系の背景は、C57BL/6株である。 あなたのES細胞がC57BL/6である場合、あなたのキメラをC57BL/6Jマウスに交差させます。 あなたが背景を変更したい場合は、標準は、選択した近交系株（約2.5年）に9シリアルクロスを行うことです。 9世代の理論的根拠は、Lee Silverによってここで説明されています。 また、世代の約半分は、マーカー支援バッククロス、またはスピードcongenicsによって必要とされます。最大の再生のために、CD1のような異系統株にあなたのマウスを交差させます。 CD1マウスは、スイスのマウスに由来した遺伝的変異の高度を持っており、堅牢な再生のために選択されました。

EUCOMMからの条件付き対立遺伝子を持つES細胞
EUCOMMからの各細胞株は、材料移転契約を完了する必要があります。 できるだけ早くこのプロセスを開始してください。
マウスの生成時間と実験マウスの生成に必要な交配数が、マウスの遺伝学に慣れていない人には驚くべき時間に組み合わされているので、先に計画してください。 マウスの生成時間（性的に成熟した成人から性的に成熟した子孫までの時間）は約3ヶ月である。
EUCOMM条件対立遺伝子は、典型的にはFrt-隣接カセット（”Frt-ed”カセット）を有する。 カセットにカセットに事実上すべての接続を転換する対立遺伝子にこの構成の機能損失の突然変異をするスプライスのアクセプターがあります。 条件対立遺伝子を生成するためには、Ｆｒｔ隣接カセットをＦｌｐｅ発現マウスに交差させることによって除去する必要がある。 Ｆｌｐｅ／Ｆｒｔシステムは同等であるが、Ｃｒｅ／Ｌｏｘｐシステムとは異なる。
宿主の胚にES細胞を注入してキメラマウスを作ります。 そこから、あなたは突然変異（生殖細胞伝達）を運ぶマウスを生成するためにマウスを繁殖させます。 マウスのこの創設者の生成は、条件対立遺伝子を生成し、Frt-edカセットを除去するためにFlpeを発現するマウスに交配することができます。 次に、実験マウスを生成するためにさらにいくつかの十字を行う必要があります。

1. ES細胞注射から成人の性的に成熟したキメラまでは、マウスの生成時間（3ヶ月）である。
2. キメラを野生型マウスに繁殖させ、生殖系列に変異体を樹立する（3ヶ月）。
3. ヘテロ接合型frtd条件付きマウスは、ホモ接合体を発現するFlpeに交配される。 これは、Flpe/o、frtd条件付き/+子孫を生成します。 （3ヶ月）
4. Flpe/o、frtd条件付き/+マウスを野生型に交配し、生殖系列に切除された対立遺伝子を確立し、Flpeを繁殖させ、これらの条件付き/+マウス（3ヶ月）で切除が分子的に検証される。
5. 条件付き/+マウスは、その後、ホモ接合条件付き対立遺伝子マウス（3ヶ月）を作るためにお互いに繁殖させました。
6. 条件付き/条件付きマウスを組織特異的-Cre/組織特異的-cre,null/+マウスに飼育し、実験組織特異的-Cre/o,条件付き/nullマウスと対照組織特異的-Cre/o,条件付き/+マ

さらに、Fple、null、Creマウスを取得する必要があり、組織特異的-Cre/組織特異的-cre、null/+マウスを飼育する必要があります。
また、条件対立遺伝子を分析して、それがCreで切除する前に機能的に野生型であり、Creで切除した後にnullであるかどうかを判断する必要があります。 条件付き対立遺伝子が切除前の機能において野生型であるかどうかを決定するために、条件付き／条件付きおよび条件付き／ヌル変異体を調べて、そ 本発明は、Ｐｒｏ２ ２ ４、ＰＲＯ９ ７ ８ ３、ＰＲＯ１ １ ０ ８、ＰＲＯ３ ４ ０ ０ ０、ＰＲＯ２ ４ ０、ＰＲＯ９ ４ ３、ｈｕＡ３ ３、ＰＲＯ２ ３ ０、ＰＲＯ１ ７ ８、ＰＲＯ１ １ ９ ９、ＰＲＯ４ ３ ３ ３、ＰＲＯ１ ３ ３ ６、ＰＲＯ１ ９ ５ ９ ８、ＰＲＯ１ ０ ８ ３、ｈｕＴＲＰＭ２又はＰＲＯ１ ８ ０ １産物は薬学的に許容される塩であり、Ｐｒｏ２ ２ ４、ＰＲＯ９ ７ ８ ３、ＰＲＯ１ １ ０ ８、ＰＲＯ３ ４ ０ ０ ０、ＰＲＯ２ ４ ０、ＰＲＯ９ ４ ３、ｈｕＡ３ ３、
RosaReporterのようなCre活性のレポーター、またはより理想的には、免疫蛍光により目的のタンパク質が標的細胞に存在しないことを直接示すことが重要な対照で RosaReporterはCreにさらされたすべての細胞で永久的なβ-ガラクトシダーゼ発現を生成します。
過剰なCre発現は、条件対立遺伝子の機能とは無関係の表現型を引き起こす可能性がある染色体破損につながる可能性があります。 したがって、Creを発現するが、いくつかの遺伝子機能（例えば、条件付き/+）を保持する兄弟マウスは、重要な対照である。