Una Panoramica di Chemogenetics

a Causa di significativi sviluppi delle neuroscienze tecniche, i ricercatori sono ora in grado di sfruttare in modo selettivo sistemi neurali in animali coscienti, attraverso metodi emergenti chiamato chemogenetics e optogenetics. Questi metodi aiutano ad esplorare i circuiti neurali alla base di comportamenti intricati nella malattia e nella salute.

Chemogenetica e optogenetica mostrano somiglianze nel loro approccio di modificare l’attività neuronale; ad esempio, in entrambe le tecniche, i canali ionici o i recettori ingegnerizzati devono essere introdotti in particolari regioni cerebrali, attraverso l’espressione di plasmidi o sistemi di vettori virali. In optogenetica, i canali ionici batterici sensibili alla luce devono essere espressi e anche le fibre ottiche devono essere successivamente utilizzate per inibire o attivare l’attività neuronale in vivo o in vitro (Boyden et al., 2005; Zhang et al., 2007).

Sebbene questo metodo offra un controllo temporale superiore dell’attività neuronale in vivo, è noto per essere intrinsecamente invasivo e richiede l’impianto cerebrale di fibre ottiche. La chemogenetica, d’altra parte, non ha bisogno di un impianto cronico ma mantiene il potenziale per controllare l’attività neuronale. Ciò si ottiene somministrando ligandi, selettivi per canali ionici o recettori ingegnerizzati, che sono altrimenti inerti (Armbruster et al., 2007; Campbell & Marchant, 2018). La tabella 1 mostra le principali caratteristiche della chemogenetica e dell’optogenetica.

Tabella 1. Chemogenetics vs optogenetics

Storia e Sviluppo

RASSLs

Chemogenetics si riferisce all’uso di canali ionici o geneticamente recettori e ligandi selettivi attivazione di recettori per facilitare la manipolazione di attività neuronale. In questo contesto, i recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) hanno guidato lo sviluppo della chemogenetica e il documento originale che definisce i GPCR che reagiscono solo ai ligandi sintetici è stato pubblicato nel 1998.

Questi recettori — noti come recettori attivati esclusivamente da un ligando sintetico (RASSLs) — sono stati efficacemente applicati in vivo, ad esempio, per controllare a distanza l’attività cardiaca. Nonostante questo fatto, l’applicazione di RASSLs nelle neuroscienze è stata limitata dall’attività endogena dei recettori in assenza del loro particolare ligando e dall’attività farmacologica dei ligandi in vivo (Coward et al., 1998; Sternson & Roth, 2014).

DREADDs

Gli ultimi anni hanno visto lo sviluppo di recettori Designer attivati esclusivamente da farmaci Designer (DREADDS). I recettori muscarinici umani mutati stimolati solo da ligandi inerti sono stati i primi DREADD ad essere sviluppati (Armbruster et al., 2007). Attraverso diversi cicli di mutagenesi e screening contro il ligando biologicamente inerte Clozapina N-ossido (CNO), sono stati identificati i recettori muscarinici accoppiati alla via di segnalazione intracellulare Gaq.

I recettori accoppiati a questa via sono in grado di attivare l’attività neuronale in risposta al CNO. Basse concentrazioni di CNO attivano tutti e tre i Gaq-DREADD: hM1Dq, hM3Dq e hM5Dq (Roth, 2016). Inoltre, lo stesso studio ha rivelato che hM4Di e hM2Di possono inibire l’attività neuronale tramite il loro accoppiamento alle vie di segnalazione intracellulari Gai. Questi DREADDs inibitori rispondono anche a CNO (Armbruster et al., 2007; Figura 1).

Figura 1. Meccanismo d’azione dei leganti DREADD. Il legame dei leganti DREADD con i Gaq-DREADDs provoca il fuoco neuronale, mentre il legame con i Gai-DREADDs provoca l’inibizione dell’attività neuronale. Clozapina N-ossido dicloridrato e agonista DREADD 21 sono agonisti muscarinici DREADD non selettivi e quindi possono attivare o inibire l’attività neuronale, a seconda del recettore specifico espresso. La salvinorina B è selettiva per il recettore KORD, che è accoppiato alla segnalazione GaI, di conseguenza il legame provoca l’inibizione dell’attività neuronale. Credito immagine: Tocris Bioscience

Il legame tra Gaq-DREADDs e CNO provoca la stimolazione della fosfolipasi C (PLC), che catalizza la conversione del fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PIP2) in 1,2-diacilglicerolo (DAG) e inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3). Sia il DAG che l’IP3 possiedono funzioni di secondo messaggero: quest’ultimo si lega ai suoi recettori per innescare il rilascio di Ca2+ dalle riserve intracellulari, mentre il primo stimola varie forme di protein chinasi C (PKC).

Il legame tra Gai-DREADDs e CNO provoca l’inibizione dell’adenilil ciclasi (AC), con conseguente diminuzione dei livelli di cAMP intracellulare. Poiché sia l’EPAC che la protein chinasi A (PKA) sono attivati dal CAMP, l’azione del CNO a Gai-DREADDs inibisce la segnalazione a valle di EPAC e PKA (vedere Figura 1).

Il CNO è un metabolita della clozapina, studi indicano che si tratta di una conversione bidirezionale e che il CNO può subire un metabolismo inverso a clozapina. Quando CNO viene somministrato alle concentrazioni necessarie per attivare DREADDs, clozapina è successivamente in grado di attivare i recettori endogeni (Gomez et al., 2017). La clozapina — un antipsicotico atipico-agisce su una serie di bersagli e porta a molti effetti comportamentali diversi.

Ratti, topi, umani, primati non umani e porcellini d’india mostrano tutti il metabolismo reversibile di CNO in clozapina (Gomez et al., 2017; Manvich et al., 2018). Come risultato del potenziale metabolismo inverso di CNO, gli studi sulla relazione struttura-attività si sono evoluti per sviluppare ligandi stabili e alternativi.

Il potente legante DREADD — DREADD agonist 21 — è stato inizialmente analizzato per l’attività contro hM3Dq. Il farmaco approvato perlapina è stato identificato come un potente agonista hM3Dq nella stessa ricerca. In Giappone, questo farmaco è stato approvato come sedativo e ipnotico (Chen et al., 2015). Sia perlapina e DREADD agonist 21 sono stati successivamente dimostrato di essere potenti agonisti di hM4Di, hM3Dq, e hM1Dq con poca o nessuna attività off-target. Inoltre, DREADD agonist 21 è stato testato in vivo, in cui è stato dimostrato di attivare i neuroni che esprimono hM3Dq e inibire l’attività dei neuroni che esprimono hM4Di (Thompson et al., 2018).

Successivamente allo sviluppo dei DREADD muscarinici, è stato creato un DREADD inibitorio dal recettore κ-oppioide (KORD). L’attivazione di questo DREADD inibitorio si ottiene attraverso il legame del ligando Salvinorina B, con conseguente inibizione dell’attività neuronale attraverso la segnalazione Gai. Per consentire il controllo bidirezionale dell’attività neuronale, KORD può essere utilizzato a fianco, attivando DREADD come hM3Dq (Vardy et al., 2015).

Alcune caratteristiche comuni in tutti i DREADDs li rendono adatti per l’applicazione in esperimenti di neuroscienze. In primo luogo, i DREADD non mostrano alcuna risposta ai ligandi endogeni a causa di mutazioni genetiche all’interno dei loro siti di legame del ligando che eliminano il legame, implicando che qualsiasi attività del DREADD sarà solo a causa delle applicazioni del ligando specifico DREADD. In secondo luogo, l’espressione in vitro o in vivo dei DREADD non ha alcun impatto sui comportamenti di base, sulla funzione neuronale o sull’attività cellulare, prima dell’aggiunta del ligando DREADD (Sternson & Roth, 2014).

PSAM/PSEM

Mentre DREADDs e RASSLs sono basati su GPCRs, canali ionici modificati denominati Moduli attuatore farmacologicamente selettivi (PSAM), sono stati utilizzati anche per modulare l’attività dei neuroni. Gli PSAM si basano su studi che indicano che è possibile trapiantare il dominio di legame extracellulare del ligando del recettore ACh nicotinico α7 (nAChR) sul dominio dei pori ionici di altri canali ionici ligando-gated. Quando il dominio di legame del ligando α7 nAChR viene impiombato con il dominio dei pori ionici del recettore 5-HT3, viene prodotto un canale ionico con farmacologia α7 nAChR ma con proprietà di conduzione del catione 5-HT3 (Eiselé et al., 1993).

Allo stesso modo, lo splicing del dominio di legame del ligando α7 nAChR con il dominio dei pori ionici del recettore selettivo della glicina del cloruro (GlyR) produce un canale di cloruro reattivo ACh (Grutter et al., 2005). La mutazione selettiva del dominio di legame del ligando α7 nAChR genera di conseguenza canali ionici PSAM, che non mostrano alcun legame ACh, ma sono ancora selettivamente legati da composti chiamati molecole effettrici farmacologicamente selettive (PSEM).

PSAM o canali ionici chimerici che consentono la regolazione della conduttanza anionica o cationica sono stati prodotti attraverso la combinazione del dominio di legame del ligando α7 nAChR mutato (che ospita due o una mutazione) con il dominio dei pori ionici di diversi canali ionici ligando-gated. Tali chimere PSAM sono denominate in base alle loro mutazioni e al dominio dei pori ionici collegati-PSAML141F, Y115F-GlyR, PSAML141F-GlyR,PSAML141F, Y115F-GABAC e PSAML141F,Y115F-5-HT3. L’attivazione dell’attività neuronale è abilitata dalle chimere contenenti 5-HT3, mentre le chimere contenenti GABAC e GlyR sono inibitorie (vedi Figura 2) (Magnus et al., 2011; Sternson & Roth, 2014).

Figura 2. Meccanismo d’azione degli PSEM. Gli PSAM attivanti sono composti da un dominio di legame del legante α7 nAChR mutato impiombato con il dominio del poro ionico di un canale cationico-selettivo, come 5-HT3. Il legame degli PSEM con l’attivazione degli PSAM provoca un afflusso di cationi e l’attivazione dell’attività neuronale. Gli PSAM inibitori sono composti da un dominio di legame del legante α7 nAChR mutato giuntato con il poredomain ionico di un canale selettivo dell’anione, come il GlyR. Il legame degli PSEM con gli PSAM inibitori provoca un afflusso di anioni e l’inibizione dell’attività neuronale. Credito di immagine: Tocris Bioscience

Recensioni scientifiche per ulteriori letture

• Campbell & Marchant (2018) L’uso della chemogenetica nelle neuroscienze comportamentali: varianti del recettore, approcci di targeting e avvertimenti. Br J Pharmacol. 175, 994.
• Roth (2016) DREADDs per neuroscienziati. Neurone. 89, 683.
• Magnus et al. (2011) Ingegneria chimica e genetica delle interazioni selettive del canale ligando-ionico. Scienza. 333, 1292.
• Sternson & Roth (2014) Strumenti chemogenetici per interrogare le funzioni cerebrali. Annu Rev Neurol. 37, 387.

1. Armbruster et al. (2007) Evolvendo la serratura per adattarsi alla chiave per creare una famiglia di recettori accoppiati alla proteina G potentemente attivati da un ligando inerte. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America. 104, 5163.
2. Atasoy et al. (2012) Decostruzione di un circuito neurale per la fame. Natura. 488, 172.
3. Boyden et al. (2005) Millisecondo-Scala temporale, controllo ottico geneticamente mirato dell’attività neurale. Nat Neurosci. 8, 1263.
4. Bradley & Tobin (2016) Progettazione di farmaci recettori accoppiati alla proteina G di nuova generazione: collegamento di nuovi modelli farmacologici e in vivo animali. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 56, 535.
5. Bradley et al. (2018) L’uso di approcci chemogenetici per studiare i ruoli fisiologici dei recettori muscarinici dell’acetilcolina nel sistema nervoso centrale. Neurofarmacologia. 136, 421.
6. Chen et al. (2015) I primi studi di relazione struttura-attività per i recettori designer attivati esclusivamente da farmaci designer. ACS Chem Neuroscienze. 6, 476.
7. Coward et al. (1998) Controllo della segnalazione con un recettore Gi-accoppiato specificamente progettato. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America. 95, 352.
8. Eiselé et al. (1993) Il recettore nicotinico-serotoninergico chimerico combina il legame del ligando e le specificità del canale. Natura. 366, 479.
9. Ge et al. (2017) Le proiezioni glutammatergiche dalla corteccia entorinale al giro dentato dorsale hanno mediato il ripristino indotto dal contesto della ricerca di eroina. Neuropsicofarmacologia. 42, 1860.
10. Gomez et al. (2017) La chemogenetica ha rivelato: occupazione e attivazione di DREADD tramite clozapina convertita. Scienza. 357, 503.
11. Grutter et al. (2005) Regolazione molecolare del gating veloce nei canali ionici ligando-gated pentamerici. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America. 102, 18207.
12. Jiang et al. (2018) I neuroni colinergici nel setto mediale mantengono comportamenti ansiosi indotti dal dolore infiammatorio cronico. Neurosci Lett. 671, 7.
13. Manvich et al. (2018) L’agonista DREADD clozapine N-oxide (CNO) è metabolizzato inverso a clozapina e produce effetti di stimolo interocettivo simili a clozapina in ratti e topi. Sic Rep. 8, 3840.
14. Rapanelli et al. (2017) Modulazione dell’istamina del circuito dei gangli della base nello sviluppo del grooming patologico. Proc Natl Acad Sci Stati Uniti d’America. 114, 6599.
15. Sasaki et al. (2011) La modulazione farmacogenetica dei neuroni dell’orexina altera gli stati di sonno/veglia nei topi. PLoS Uno. 6, e20360.
16. Schwartz et al. (2017) La regolazione Cortico-accumbens del comportamento di evitamento dell’approccio è modificata dall’esperienza e dal dolore cronico. Cella 19, 1522.
17. Thompson et al. (2018) DREADD agonist 21 (C21) è un agonista efficace per i DREADD a base muscarinica in vitro e in vivo. ACS Pharmacol Transl Sci. Epub prima della stampa.
18. Vardy et al. (2016) Un nuovo DREADD facilita l’interrogatorio chemogenetico multiplex del comportamento. Neurone. 86, 936.
19. Varela et al. (2016) Monitoraggio del ruolo dipendente dal tempo dell’ippocampo nel richiamo della memoria usando i DREADDs. PLoS Uno. 11, e0154374.
20. Zhang et al. (2007) Interrogazione ottica veloce multimodale di circuiti neurali. Natura. 446, 633.

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