Un pannello di citometria a flusso a 10 colori per la diagnosi e la misurazione minima della malattia residua nella leucemia linfocitica cronica

Background: La leucemia linfocitica cronica (CLL) ha un immunofenotipo classico, costituito da restrizione a catena leggera, CD5+, CD19+, dim CD20, CD23+, CD43+, CD200+, CD10 – e CD79b-. Questo lo distingue dalle normali cellule B e da altri disturbi linfoproliferativi (LPD). Gli anticorpi mirati a questi antigeni sono inclusi in due pannelli di citometria a flusso a 8 colori sviluppati dal consorzio Euroflow per l’elaborazione di LPD a cellule B. La combinazione di questi anticorpi in un pannello di 10 colori sarebbe più conveniente. Inoltre, le nuove terapie per la LLC possono indurre remissioni profonde, creando una crescente richiesta di misurare la malattia residua minima (MRD), definita come avere oltre 1 cellula leucemica residua ogni 10.000 leucociti (10-4). L’attuale approccio standardizzato internazionale per la misurazione della MRD stabilito dall’Iniziativa europea di ricerca sulla CLL (ERIC) utilizza un gruppo di anticorpi destinati a CD3, CD5, CD19, CD20, CD22, CD43, CD79b e CD81. Tuttavia, queste combinazioni anticorpo-fluorocromo sono diverse da quelle utilizzate dai pannelli diagnostici Euroflow. Pertanto, i laboratori che intendono implementare i test MRD dovrebbero acquistare anticorpi per 3 diversi pannelli (2 diagnostici e 1 MRD). Abbiamo ampliato il tubo di screening linfocitario a 8 colori Euroflow (LST) per includere CD200 e CD23, in modo tale che la CLL possa essere rilevata in un tubo a 10 colori, a livelli fino allo 0,01%. L’obiettivo di questo studio era determinare i potenziali risparmi sui costi nell’implementazione di questo nuovo pannello e determinare se è abbastanza sensibile da rilevare MRD.

Metodi: Abbiamo calcolato il numero di campioni analizzati con il nostro tubo LST modificato a 10 colori (mLST1, ottenuto liofilizzato) da aprile 2018 a marzo 2019 per escludere un LPD e il numero di aliquote anticorpali salvate utilizzando questo approccio rispetto al metodo standard Euroflow a 2 tubi. Abbiamo anche creato una versione del pannello sopra menzionato (mLST2) utilizzando anticorpi liquidi per aumentare la generalizzabilità dei nostri risultati, sostituendo CD38 con CD43 per vedere se questo ha migliorato il rilevamento MRD (vedi pannelli sotto). Per la prova di MRD, abbiamo usato i campioni di CLL da 24 pazienti differenti per produrre 60 campioni di MRD alle varie concentrazioni delle cellule leucemiche. I campioni sono stati preparati inserendo cellule CLL in sospensioni di leucociti normali a concentrazioni approssimative di 0,1%, 0,01% e 0,001%. Ogni campione è stato aliquotato e macchiato con i tre pannelli: ERIC, mLST1 e mLST2. I dati sono stati acquisiti utilizzando un BD FACSCanto II o un BD FACSAria Fusion e analizzati utilizzando il software BD FACSDiva. Le cellule di CLL sono state identificate in base all’espressione differenziale dei marcatori chiave e la MRD è stata calcolata come il numero di cellule di CLL/leucociti totali. La positività alla MRD è stata definita ≥ 0,01%. L’accordo tra i pannelli è stato valutato utilizzando il metodo Bland-Altman plot. Abbiamo anche calcolato l’accordo percentuale tra i pannelli per identificare la positività MRD.

Risultati: In 1 anno, mLST1 è stato eseguito su 474 campioni, di questi 220 avevano un LPD e 123 (56%) avevano un fenotipo CLL classico, ovviando alla necessità di ulteriori test. Ciò ha comportato un risparmio netto di 476 aliquote anticorpali. Per la valutazione della MRD, l’espressione differenziale di CD5 e CD20 sono stati i contributori più significativi nel distinguere la CLL dalle cellule B normali utilizzando mLST1 e mLST2. Abbiamo identificato un caso di CLL con un immunofenotipo atipico (dim CD5, bright CD20) che si è rivelato difficile da cancellare utilizzando un pannello mLST. I risultati della MRD ottenuti con i gruppi mLST e ERIC sono stati concordati. Per valori superiori al limite di quantificazione, il limite del 95% di accordo era ±0,3369 log per il confronto ERIC vs mLST1 e ±0,3485 log per il confronto ERIC vs mLST2. Pertanto, la variabilità dei livelli di MRD tra i pannelli era inferiore a 2 volte la maggior parte del tempo, che abbiamo considerato clinicamente accettabile poiché l’MRD è misurato su una scala esponenziale. Il panel ERIC e il mLST1 avevano un accordo dell ‘ 88,3% nel distinguere i campioni MRD-positivi da quelli MRD-negativi. L’accordo è stato del 93,3% tra il panel ERIC e il mLST2.

Conclusioni: È possibile utilizzare un pannello LST a 10 colori modificato sia per la diagnosi che per la misurazione della MRD di CLL. I vantaggi sono una maggiore familiarità con gli anticorpi e potenziali risparmi sui costi, rendendo MRD accessibile a più laboratori di citometria. Casi atipici di CLL senza la solita positività CD5 e dim CD20 sono molto difficili da cancellare usando un pannello LST. In questi casi, il pannello ERIC è chiaramente superiore come CD22, CD79b, CD81 e CD43 può ancora fornire la separazione tra i linfociti maligni e normali.

Informazioni

Bazinet:BD Biosciences: Altro: Ha fornito gratuitamente una quantità significativa degli anticorpi utilizzati in questo progetto.. Wever: Innovazione Teva Canada: Occupazione. Gimmig: BD Biosciences: Occupazione. Johnson:Lundbeck: Occupazione, Onorari, di Appartenenza a un’entità del Consiglio di Amministrazione o comitati consultivi Altre: spese relative a Viaggi, regali, e gli altri, il Finanziamento della Ricerca; Merck: Consulenza, Onorari; Roche: la Consulenza, l’Occupazione, gli Onorari di Appartenenza a un’entità del Consiglio di Amministrazione o comitati consultivi Altre: spese relative a Viaggi, regali, e gli altri, il Finanziamento della Ricerca; Abbvie: la Consulenza, l’Occupazione, gli Onorari di Appartenenza a un’entità del Consiglio di Amministrazione o comitati consultivi, di Finanziamento della Ricerca; BD Biosciences: Altro: Fornito una percentuale significativa degli anticorpi utilizzati in questo progetto gratuitamente.; BMS: Consulenza, Onoraria; Seattle Genetics: Onoraria.

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