In questo video potrete osservare come eseguire il test di rilascio di cromo e determinare il potenziale citotossico delle cellule effettrici.
Le cellule immunitarie sono responsabili dell’identificazione e della rimozione di cellule potenzialmente dannose, come il cancro o le cellule infette da virus, dal corpo, che è parte integrante della risposta immunitaria. Diverse cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule NK, possiedono una proprietà nota come potenziale citotossico, che è la capacità di identificare le cellule bersaglio e secernere proteine che inducono la degradazione proteica, la lisi e la morte di quelle cellule bersaglio. Quantificare il potenziale citotossico è fondamentale per misurare l’attivazione e la potenza delle cellule immunitarie e il test di rilascio del cromo è comunemente usato per questo scopo.
Questo metodo consente agli utenti di confrontare la citotossicità indotta da specifici tipi di cellule immunitarie in condizioni diverse, che è preziosa per lo studio dell’immunoterapia del cancro e delle malattie correlate all’immunità. Per iniziare, le cellule bersaglio, come le cellule tumorali, vengono incubate con un isotopo radioattivo, il cromo 51, che viene assorbito dalle cellule. Successivamente, queste cellule radio etichettate sono co-coltivate con le cellule immunitarie isolate di interesse, chiamate anche cellule effettore, in un fondo rotondo, piastra a 96 pozzetti per facilitare l’interazione tra i due tipi di cellule.
La configurazione complessiva del test prevede l’incubazione di un numero specifico di cellule bersaglio con diverse concentrazioni delle cellule immunitarie, insieme a controlli appropriati. La co-coltura consente alle cellule effettrici di indurre apoptosi e lisi nelle cellule bersaglio, con conseguente rilascio del cromo intracellulare 51 nel surnatante. Quindi, in un momento preottimizzato, il surnatante contenente il cromo rilasciato viene raccolto da tutti i pozzetti. Il cromo 51, essendo radioattivo, subisce spontaneamente decadimento radioattivo per emettere radiazioni gamma. I livelli di radiazione gamma nei supernatanti provenienti da tutti i pozzetti della piastra di analisi rappresentano un output quantificabile della lisi delle cellule bersaglio. Questo viene misurato utilizzando un contatore gamma, che viene poi utilizzato per determinare il potenziale citotossico delle cellule immunitarie.
Per iniziare, le cellule bersaglio, linea cellulare melanoma umano WM793 in questo esempio, vengono preparati in una singola sospensione cellulare. Per fare ciò, rimuovere prima il supporto dal pallone di coltura del tessuto e lavare le cellule con cinque millilitri di 1X PBS. Decantare il PBS e quindi aggiungere un millilitro di tripsina alla piastra per circa due minuti. Picchiettare delicatamente il pallone per allentare le celle dalla superficie del pallone e quindi aggiungere cinque millilitri di media RPMI al pallone. Pipettare il supporto su e giù per raccogliere le cellule e aggiungere questa sospensione ad un tubo conico da 15 millilitri.
Posizionare il tubo nella centrifuga per cinque minuti a 1200 giri / min. Quindi, rimuovere il supporto dal tubo facendo attenzione a non interrompere il pellet cellulare. Flick delicatamente la parte inferiore del tubo per interrompere il pellet cellulare e aggiungere 10 millilitri di media al tubo. Quindi, pipettare delicatamente il supporto su e giù per portare le cellule in sospensione. Successivamente, determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e trasferire due millilitri della sospensione cellulare originale in un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Posizionare il tubo in una centrifuga e pellet le cellule a 12 cento RPM per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, versare il materiale in eccesso dal tubo in un contenitore di rifiuti. Vortice brevemente il tubo per risospendere il pellet cellulare nel piccolo volume di mezzo lasciato alle spalle.
Quindi, preparati a usare Chromium 51 spostandoti in uno spazio di laboratorio dedicato a questa particolare radioattività. Ci dovrebbe essere un’ampia schermatura del piombo per la conservazione e l’uso sicuri del cromo 51 durante tutte le fasi, nonché una segnaletica adeguata per indicare dove vengono conservati i campioni con cromo 51. Un contatore Geiger dotato di una sonda pancake è anche necessario per servire nello spazio per possibili contaminazioni.
Una volta impostato per l’uso corretto della radioattività, aggiungere 100 microcurie di cromo 51 direttamente alla sospensione della cellula bersaglio. Quindi, aggiungere un piccolo pezzo di nastro radioattivo al tubo per indicare che il campione e il tubo sono ora radioattivi. Posizionare il tubo in un incubatore a 37 gradi Celsius con uno scudo di piombo e incubare per un’ora, sfogliando il tubo ogni 15-20 minuti.
Mentre le cellule bersaglio sono etichettate, preparare una sospensione monocellulare di cellule effettrici. In questo esempio, le cellule mono-nucleari del sangue periferico umano, o PDMC, sono state isolate dal sangue intero mediante centrifugazione standard del gradiente di densità ad una concentrazione di 5 volte 10-6. Trasferire questa sospensione della cella effettuatrice in un serbatoio di reagente monouso e quindi aggiungere 200 microlitri di questa sospensione in ciascun pozzetto della riga B in una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di RPMI a ciascun pozzetto nella riga C attraverso G della piastra.
Ora, iniziare a eseguire diluizioni seriali dei PBMC per avere un intervallo di numeri di cellule effettori rimuovendo prima 100 microlitri delle cellule nei pozzetti nella riga B e aggiungendolo alla riga C. Quindi, diluire ulteriormente le cellule effettori trasferendo 100 microlitri di cellule dalla riga C alla riga D. Continuare la diluizione seriale. Una volta raggiunta la riga G, spostare 100 microlitri dai pozzetti per lasciare un volume finale di 100 microlitri in ciascun pozzetto in quella riga. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura tissutale ai pozzetti della riga A per fungere da controllo per il rilascio spontaneo di cromo 51 dalle cellule bersaglio, poiché a questa riga non devono essere aggiunte cellule effettrici. Quindi, posizionare un piatto in un incubatore di 37 gradi Celsius fino a quando le cellule bersaglio sono pronte per essere aggiunte.
Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le cellule bersaglio dall’incubatore e lavare con 5 millilitri di FBS per rimuovere l’eccesso di cromo 51. Quindi, posizionare il tubo in una centrifuga designata e girare a 1200 giri / min per 5 minuti. Rimuovere il lavaggio FBS radioattivo in un apposito contenitore di rifiuti e ripetere la fase di lavaggio risospendendo il pellet in un fresco 5 millilitri di FBS. Posizionare il tubo in una centrifuga designata e far girare nuovamente le celle a 1200 giri / min per 5 minuti. Rimuovere il secondo lavaggio e controllare la radioattività incorporata del pellet utilizzando un contatore Geiger. Infine, Risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo completo e versare il cromo 51 etichettato, sospensione cellulare bersaglio in un serbatoio di reagente usa e getta. Quindi, aggiungere 100 microlitri di queste cellule bersaglio etichettate ad ogni pozzetto della piastra cellulare effettore a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di 1% NP-40 in acqua ai pozzetti nella riga H per lisare tutte le cellule bersaglio in ogni riga. Questi pozzi saranno utilizzati come controllo per determinare i conteggi totali al minuto, o cpm.
Ora che la piastra è preparata, fissare il coperchio aggiungendo un piccolo pezzo di nastro su ciascun lato della piastra e posizionare un pezzo di nastro radioattivo sul coperchio per indicare che contiene cromo 51. Quindi, posizionare la piastra in una centrifuga contrassegnata per gestire campioni radioattivi. Se viene utilizzata solo una piastra sperimentale, aggiungere una piastra di bilanciamento alla centrifuga. Impostare la centrifuga a 1200 giri / min e portare la piastra a velocità. Una volta alla velocità, ferma la macchina. Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Quindi, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con un piccolo pezzo di schermatura di piombo sopra la piastra per una maggiore sicurezza. Incubare per 16 ore per consentire alle cellule bersaglio di lisare.
Alla fine del periodo di incubazione, rimuovere con attenzione il nastro attorno al bordo della piastra e rimuovere il coperchio. Successivamente, posizionare il telaio di raccolta sulla piastra assicurandosi di confermare che i piccoli dischi filtranti sono in posizione per ciascuno dei tappi di cotone. Ora, premere lentamente e delicatamente i tappi di cotone nei pozzetti. Dopo circa dieci secondi, rilasciare la pressione sui tappi di cotone, quindi trasferire i tappi di cotone sulle strisce del tubo. Posizionare ciascuno di questi tubi in un tubo FACS secondario. Infine, caricare i tubi FACS su un contatore gamma ed eseguire i campioni per quantificare la quantità di cromo 51 rilasciato in ogni condizione. Registrare con attenzione l’ordine in cui i tubi sono stati caricati nel contatore.
Qui, i PBMC non stimolati sono stati aggiunti alle prime 3 corsie e i PMBC stimolati da CPG sono stati aggiunti alle corsie da 4 a 6. In questo esempio, i conteggi al minuto sono stati inseriti nelle celle di un foglio di calcolo nello stesso modo in cui i campioni sono stati disposti nella lastra originale e sono state calcolate le medie dei triplicati. Ad esempio, per la prima condizione, le celle A1, A2 e A3 sono state calcolate in media nella cella I3. Una volta determinate le medie, la percentuale di lisi specifica per ciascuna condizione può essere calcolata utilizzando questa formula. Ad esempio, per calcolare la percentuale di lisi specifica per le cellule non stimolate che avevano un rapporto di 50 a 1 cellule effettore per le cellule bersaglio, il CPM spontaneo, che in questo esempio è 1164.67, è stato sottratto dal CPM sperimentale, 1129. 67. Questo numero può quindi essere diviso per la differenza tra il CPM massimo e il CPM spontaneo e quindi moltiplicato per 100 per dare la percentuale di lisi specifica. Questo viene quindi calcolato per ogni condizione. Questi dati possono quindi essere graficamente per mostrare il confronto del rapporto E a T con la percentuale di lisi specifica sia per i PBMC non stimolati, sia per i PBMC stimolati da CPG. In questo esempio, le cellule effettrici stimolate con CPG hanno ucciso più efficacemente le cellule bersaglio quando il rapporto tra cellule effettrici e cellule bersaglio è aumentato. Questo aumento non è stato osservato nelle PBMC non stimolate, indicando che la stimolazione CPG è necessaria per l’aumento osservato nella lisi delle cellule bersaglio.