Piante e l’agente patogeno
comune stabilimento di produzione del ghiaccio (Mesembryanthemum crystallinum L.) è stato coltivato in serra, come descritto da Kuźniak et al. . Dopo la comparsa della coppia di foglie 3rd, un set di piante è stato irrigato con NaCl 0.4 M per indurre il metabolismo acido Crassulacean (piante CAM) mentre un altro è stato ulteriormente irrigato con acqua di rubinetto (piante C3). Dopo 12 giorni, l’induzione di CAM nelle piante trattate con NaCl è stata confermata misurando il di malato diurno nella linfa delle cellule fogliari. Successivamente le foglie delle coppie di foglie 2nd di piante C3 e CAM sono state inoculate con Botrytis cinerea secondo Kuźniak et al. .
Clorofilla a fluorescenza imaging
La versione Mini di un Imaging-PAM clorofilla Fluorometro M-Series (Walz, Effeltrich, Germania) dotato di un supporto foglia è stato utilizzato per registrare fluorescenza imaging (Imaging-PAM M-serie clorofilla Fluorometro) . Il fluorometro è un modello della clip della foglia per le applicazioni del campo. Il supporto della foglia assicura che la foglia sia tenuta orizzontale alla sorgente luminosa per evitare l’illuminazione eterogenea sopra le aree differenti del campione della foglia. Le posizioni di campionamento sono state scelte per essere equidistanti lungo la nervatura mediana, tuttavia differivano leggermente per qualsiasi foglia a causa delle sue dimensioni e morfologia e della tecnica di posizionamento delle foglie nel supporto. Per identificare solo gli effetti dello stress biotico e per evitare l’introduzione di artefatti nella procedura di misurazione della fluorescenza della clorofilla, non sono stati applicati segni di riferimento che permettessero il riferimento all’immagine delle foglie. La fluorescenza della clorofilla dalle foglie comuni delle piante di ghiaccio è stata ottenuta definendo l’area di interesse (strumento AOI) utilizzando il software Imaging Win 2.41 A.
Con l’Imaging-PAM, la resa di fluorescenza corrente (Ft) è stata continuamente monitorata. Le piante erano scure adattate per 20 min. Su applicazione di un impulso di saturazione, sono stati determinati il rendimento di fluorescenza a livello scuro (Ft = F0) e il rendimento massimo di fluorescenza (Fm). Il rendimento massimo di PSII quantum, Fv/Fm, e le rese quantistiche della dissipazione di energia regolata e non regolamentata in PSII, Y(NPQ) e Y(NO) sono stati immaginati. Fv / Fm è stato calcolato secondo l’equazione: Fv/Fm = (Fm − F0) Fm. Y (NPQ) è stato calcolato secondo Kramer et al. con la formula: 1 ‒ Y(II) – 1/(NPQ + 1 + qL (Fm / F0 − 1)). Y (NO) è stato calcolato secondo Kramer et al. dall’equazione: Y (NO) = 1/. Il processo di imaging fornisce pseudo-colore (scala di colore) immagini di materiale biologico, con una risoluzione di 640 × 480 pixel corrispondente al campo di visualizzazione delle caratteristiche fisiche dimensioni 32 × 24 mm.
Le foglie infette del C3 e CAM impianti sono stati presi per chl una analisi di fluorescenza a tempo punto di inoculazione e 3, 6, 9, 24, 32, 48, 54 e 72 ore dopo l’inoculazione. Chl è stata misurata una fluorescenza per le foglie attaccate della 2a coppia di foglie da tre piante C3 e CAM provenienti da due ripetizioni indipendenti di coltivazione delle piante. Ogni foglia prelevata per l’analisi è stata vagliata separatamente in tutti i punti temporali (Fig. 1). Serie rappresentative di nove immagini(una per ogni punto temporale) di Y(NO), Y (NPQ) e Fv/Fm per impianti di ghiaccio C3 e CAM sono state elaborate per misurare le variazioni di questi parametri in un’area selezionata della lama fogliare proiettata nel tempo. Per confronto, Y(NO), Y (NPQ) e Fv/Fm hanno calcolato la media dei dati delle intere regioni fogliari raffigurate in Fig. 2 sono stati ottenuti. I risultati dell’allineamento dell’immagine e la misurazione del pattering spaziotemporale della propagazione dello stress biotico nelle foglie con il metodo proposto sono stati esemplificati su immagini Y(NO).
Immagini di esempio della resa quantistica della dissipazione di energia non regolamentata nelle foglie comuni delle piante di ghiaccio. Si applica a PSII Y (NO) di C3 (a–d) e CAM (e–h) parametri di fluorescenza. Il frammento di foglia contiene il sito di inoculazione del patogeno e sintomi di propagazione dello stress
Immagine di esempio di foglia di pianta di ghiaccio comune C3 con regioni selezionate di interesse. Le selezioni effettuate manualmente nell’editor del firmware coprono le aree infette (1), senza sintomi (2) e le aree centrali(3)
Allineamento immagine
Il meccanismo di raccolta dati immagine PAM in sequenza temporale comporta lo spostamento del frammento di foglia nel campo visivo tra i singoli punti temporali (Fig. 1). A causa del cambiamento della posizione della foglia, caratteristiche come il midrib e i siti di inoculazione hanno sia posizione che orientamento diversi. Inoltre, si può osservare l’effetto del riscalaggio. Per valutare correttamente la propagazione dello stress, i campi della vista dovrebbero essere sincronizzati reciprocamente assumendo uno di essi come immagine di riferimento (fissa) e il resto delle immagini da allineare con quello fisso. Questo approccio è noto in imaging medico come registrazione delle immagini . Il compito di registrazione di base per le immagini a fluorescenza è quello di trovare la trasformazione di “somiglianza” che consiste in rotazione, traduzione e ridimensionamento appropriati. La piegatura della superficie fogliare e la piegatura delle foglie da stress si verificano solo nelle regioni locali di singole immagini e sono di minore importanza per l’allineamento dell’immagine globale. Possono essere compensati nella fase di post-elaborazione della registrazione mediante trasformazioni non lineari come ad esempio lastre sottili, spline superficiali e mappature demoniche .
Le immagini di fluorescenza sono prese come una serie di scatti in intervalli di tempo predefiniti di circa la stessa regione fogliare. Gli elementi caratteristici della pila considerata di immagini rappresentano principalmente le vene delle foglie. Tuttavia sono scarsamente distinguibili dal contenuto dell’immagine a causa del contrasto limitato e della moda cromatica dell’imaging PAM. Le aree di sintomi di stress che dominano visivamente il contenuto possono cambiare tra le immagini in una singola serie. In tale situazione la registrazione automatica fallirebbe.
I metodi più diffusi e automatici all’avanguardia si basano sul confronto dell’intensità dell’immagine con alcune metriche di correlazione (metodi basati sull’intensità) o si basano sulla ricerca nelle immagini fisse e in movimento per la corrispondenza tra le caratteristiche dell’immagine selezionate come punti, linee e contorni (metodi basati sulle funzionalità) . Nessuno di questi approcci consente una corretta registrazione delle immagini di fluorescenza PAM di comuni impianti di ghiaccio, come è stato verificato e mostrato negli esempi inclusi nei materiali supplementari (file aggiuntivo 1). I risultati presentati confermano che la ragione delle registrazioni automatiche non riuscite è la forte oscuramento delle regioni dell’immagine con caratteristiche preservate da cambiamenti dinamici nel contenuto dell’immagine causati dall’infezione del tessuto fogliare. I test dei metodi popolari sono stati effettuati sia dallo stimatore di registrazione in Matlab che nell’ambiente Fiji .
L’algoritmo di registrazione delle immagini PAM è stato progettato in ambiente Matlab in base al set di punti di controllo selezionati manualmente da un esperto. Per impostare i punti di controllo corrispondenti in ogni immagine è stata applicata la funzione cpselect dello strumento di selezione del punto di controllo da Image Processing Toolbox. Le immagini sono state modificate in coppia tra cui un’immagine fissa e un’immagine in movimento. La prima immagine acquisita subito dopo l’inoculazione del patogeno è stata assunta come immagine fissa (di riferimento). Attraverso la mappatura interattiva dei punti, l’utente può indicare non solo i contorni visibili dei nervi, ma anche altri elementi caratteristici come il punto di iniezione, i siti lungo la propagazione del patogeno e le cellule della vescica epidermica più apparenti (Fig. 3).
Punti di controllo selezionati dall’esperto. Esempio Y(N) immagini di una foglia, un frammento di una CAM comune di ghiaccio impianto fisso di riferimento, immagine b immagine in movimento per essere in linea con quello fisso
Diverse paia di controllo dei punti, distribuiti come ampiamente sopra la foglia di superficie dell’immagine, sono sufficienti per allineare correttamente le immagini della foglia stessa, approssimativamente, considerata come un corpo rigido. Una distribuzione più ampia dei punti di controllo migliora la sensibilità della corrispondenza dell’immagine, ma è limitata dal campo di visualizzazione immagine ritagliato dopo la trasformazione dell’allineamento e dalla possibilità di una posizione precisa del punto selezionato sulla lama. Con tale allineamento dell’immagine la trasformazione affine è stata eseguita utilizzando la funzione fitgeotrans inclusa in Image Processing Toolbox. Questa trasformazione è stata limitata alla versione “similarità” (che consiste solo di traduzione, rotazione e somiglianza) perché la scena nel fluorometro PAM sembrava non inclinata. Le immagini in movimento sono state abbinate all’immagine fissa utilizzando la funzione imwarp. L’illustrazione grafica dell’algoritmo di registrazione è inclusa in Fig. 4.
Lo schema a blocchi di registrazione B-spline affine e opzionale applicato alle immagini PAM a fluorescenza. \(\left\)—il vettore dei punti di controllo in immagine fissa, \(\left^{\left( k \right)}\)—il vettore dei punti di controllo nella k-esima immagine in movimento, \(\left^{{\left( {k^{\prime } } \right)}}\)—il vettore dei punti di controllo nella k-esima immagine in movimento dopo la B-spline di registrazione
Lascia a vari stadi di infezione può avere una superficie a livello locale ondulato o rugosa come la regione segnata in analizzate PAM-fluorometer immagini (Fig. 5a, b), quale forma può potenzialmente influenzare la corretta analisi del fenomeno di propagazione del patogeno. Significa che il metodo di registrazione affine basato sulla trasformazione geometrica potrebbe non essere sufficiente per abbinare le immagini PAM a fluorescenza in alcuni casi di foglie con deformazione non lineare apparentemente visibile. Pertanto, gli autori propongono un metodo di registrazione a due stadi in cui la registrazione rigida affine è seguita dalla registrazione B-spline che riduce le deformazioni non lineari.
Esempio di registrazioni affine e B-spline per C3 immagine foglia di pianta di ghiaccio comune. una Y(N) immagine dopo la PAM acquisizione, b l’immagine dopo rigida trasformazione affine con le frecce che rappresentano interattivamente spostamento vettori utilizzati nella seconda fase di registrazione e c forma finale dopo il punto di controllo-base B-spline di registrazione
La scelta di non rigide tipo di registrazione sfrutta il fatto che i comuni di ghiaccio, foglie di piante rappresentano un po ‘ di materiale flessibile e piccole forze di flessione mantenere liscia modifiche in una foglia profilo di superficie. La specificità di questa modifica di registrazione è che i vettori del campo di deformazione dell’immagine devono essere imposti in modo interattivo. A tale scopo, è stato allegato all’algoritmo un editor di campi vettoriali dedicato. Solo pochi vettori di spostamento nell’immagine in movimento devono essere specificati per registrare deformazioni locali e lisce di una superficie fogliare come in Fig. 5b.
L’algoritmo B-spline Rueckert è stato selezionato per la seconda fase della registrazione. La sua implementazione è disponibile in Matlab Central File Exchange come il Dirk-Jan Kroon Spline Registration Toolbox .
B-spline procedura di registrazione si compone di due passaggi fondamentali:
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Inizializzazione di una griglia G di punti dell’immagine uniformemente distribuito su tutta la superficie dell’immagine con tutto il campo di deformazione vettori set a zero, e quindi l’elaborazione di un fitto campo del vettore T di deformazioni nella griglia G B-spline cubica interpolazione di impostare manualmente il punto di controllo di spostamento vettori \(\left^{\left( k \right)}\). Sia la griglia che il campo di trasformazione associato T vengono quindi perfezionati iterativamente in 4 passaggi per ridurre la spaziatura dei nodi della griglia. La trasformazione T viene preparata dalla funzione point_registration dalla casella degli strumenti di registrazione spline.
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B-trasformazione spline di tutte le posizioni dei pixel e interpolazioni bicubiche di componenti di colore nell’immagine mobile (affine registrata) \(I_{M}\) in base al campo di deformazione smussato spline.
Precisione di registrazione dell’immagine
L’accuratezza dell’allineamento dell’immagine proposto è stata eseguita dal quadrato medio radice (RMS) su deviazioni di N = 15 punti di controllo mostrati in Fig. 3. Lo spostamento di ogni punto di controllo dell’immagine fissa \(P_{i}\) valutato in un’immagine in movimento per il caso con e senza l’allineamento è stato illustrato in Fig. 6 come i vettori \(R_{i} P_{i} =\ Delta r_{i}\) e \(Q_{i} P_{i} =\ Delta q_{i}\) rispettivamente. Gli errori di spostamento RMS di tutti i punti di controllo in una singola immagine per i due casi sono espressi in Eq. (1) come \ (\Delta r_ {\text{rms}}\) e \(\Delta q_ {\text{rms}}\).
Illustrazione della valutazione dell’errore nella registrazione affine delle immagini PAM. \(P_{i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—punto di controllo in immagine fissa \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—mappatura del punto di controllo \(P_{i}\) dell’immagine in movimento \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mappatura del punto di controllo \(P_{\text{i}}\) dopo la registrazione, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—errore di spostamento del punto di controllo \(P_{\text{i}}\) dopo la registrazione
La percentuale di residuo di spostamento di \(\delta_{rms}\) dopo affine tipo di registrazione, può essere valutato per una sola immagine in accordo con l’Eq. (2).
Gli errori di registrazione affini valutati sono elencati nella Tabella 1. Gli spostamenti originali\(\Delta q_ {\text{rms}}\) che variano da 3,01 a 7,09 mm vengono ridotti dopo la registrazione della ‘similarità’ nell’intervallo da 0,45 a 1,71 mm di \(\Delta r_ {\text {rms}}\) per l’impianto C3 testato. Gli stessi parametri per l’impianto CAM sono \(1.90 \ div 5.69\; {\text {mm}}\) per \ (\Delta q_ {\text{rms}}\) e \(0.41 \ div 1.53\; {\text{mm}}\) per \(\Delta r_ {\text{rms}}\). Quando \(\delta_{rms}\) viene calcolata la media sia per le serie di immagini C3 che CAM, è uguale a circa il 21% e il 23% rispettivamente. I valori dei parametri di fluorescenza Y(NO), Fv/Fm e NPQ ottenuti da immagini di foglie di piante ghiacciate senza registrazione vengono recuperati da parti incompatibili della foglia e non possono essere presi in considerazione (vedere il file aggiuntivo 2).
Per ulteriori mappature di registrazione B-spline, l’errore di trasformazione è definito da due componenti. Il primo di essi è lo spostamento post registrazione \(\Delta r_{i} = R_{i} P_{i}\) mostrato in Fig. 7a, con\ (R_{i}\) valutato in Eq. (3) come il centroide \(\bar {p}\) della regione \(A_{i}\).
dove \(I_{R} \left( p \right) \in \left\) indica l’intensità di registrati punto di controllo immagine pixel per pixel p, \(\left| {A_{i} } \right|\)—offuscamento regione. Il secondo componente dell’errore è definito dal raggio di deviazione standard \ (\rho_{i}\) dell’intensità diffusa attorno a ciascun punto di controllo \(R_{i}\) come descritto in Eq. (4).
dove \(\left\| \cdot \right\|\) indica la norma Euclidea del vettore tra due punti p e \(\bar{p}\) il piano dell’immagine. La sfocatura del punto di controllo allineato \(R_{i}\) appare dovuta al fatto che la registrazione non lineare utilizza l’interpolazione bicubica nella griglia a risoluzione finita G. Questo effetto è stato misurato sperimentalmente eseguendo una determinata trasformazione B-spline nell’immagine costruita da punti di controllo bianchi su uno sfondo nero. La tabella 2 include le grandezze \ (\Delta q_{i}\) di N = 9 vettori di campo di spostamento di esempio mostrati in Fig. 5 ter. Le grandezze \(\Delta r_{i}\) degli errori di mappatura vettoriale dopo la registrazione spline sono misurate tra i punti di controllo fissi desiderati \(P_{i}\) e i centroidi dei punti registrati\ (R_{i}\) valutati nella regione\(A_{i}\). Tutti i valori testati \(\Delta r_{i}\) sono inferiori alla risoluzione dei pixel pari a \(50\; \ upmu {\text {m}}\) e possono essere trascurati-arrotondati a 0. Ciò significa un posizionamento preciso dei punti di controllo tramite la trasformazione spline. La deviazione standard \(\rho_{i}\) della regione di sfocatura mostrata nella Tabella 2 dopo il raddoppio può essere una misura della sfocatura del punto di controllo. Quindi varia approssimativamente da \(24\; {\text {a}}\; 63\; \ upmu {\text {m}}\) qual è l’equivalente della sfocatura di un pixel. Pertanto questa trasformazione consente di ripristinare localmente la forma corretta dei cambiamenti Y(NO) in un’immagine a fluorescenza.
Spiegazione dell’errore nella registrazione delle immagini B-spline delle immagini PAM. a La mancata corrispondenza della mappatura della posizione del punto di controllo durante la registrazione, b distribuzione dell’intensità dell’immagine del punto di controllo registrato spline, \(P_ {i} ,\;i = 1, \ldots ,N\)—punto di controllo in immagine fissa \(I_{F}\), \(Q_{i}\)—l’equivalente del punto \(P_{i}\) dell’immagine in movimento \(I_{M}\), \(R_{i}\)—mappatura del punto di controllo \(P_{i}\) dopo la registrazione, \(R_{i} P_{i} =\Delta r_{i}\)—cilindrata misura dell’errore di mappatura del punto di controllo \(P_{i}\), \(A_{i}\)—sfocato regione \(R_{i}\) corrispondente al punto di controllo \(P_{i}\), \(\rho_{i}\)—la deviazione standard di raggio \(R{i}\) sfocatura
La misurazione della propagazione dello stress
L’analisi dei dati applica uno strumento editor speciale per manipolare una pila di immagini PAM dopo la loro registrazione. La funzione editor principale consente di disegnare due sezioni di linea di acquisizione dati \(L_{1}\; {\text {and}}\; L_ {2}\) di uguale lunghezza (Fig. 8), che può essere osservato e disponibile su qualsiasi immagine dalla pila. Nell’esperimento considerato la prima riga \(L_{1}\) inizia nel sito di inoculazione \(s_{1}\), dove il fattore di stress viene applicato al tessuto fogliare al tempo t, e dovrebbe essere approssimativamente impostato nella direzione dell’espansione dello stress. La seconda linea \(L_{2}\) è posizionata lungo la parte mediana dove l’influenza dello stress osservata nel tempo è sempre stata limitata e i parametri di fluorescenza mostrano cambiamenti minimi. Le linee dovrebbero adattarsi interamente al contesto dell’immagine.
Regioni di misurazione in Y (NO) immagini di foglie di piante di ghiaccio comuni dopo l’allineamento del computer. I punti di misurazione indicano: (1) mesofilla nel sito di inoculazione, (2) mesofilla senza lesioni, (3) midrib vicino al sito di inoculazione. La linea di misura (L1) è orientata nella direzione della propagazione dello stress all’interno della mesofilla e la linea (L2) si trova lungo la mediana. Linee iniziate dai punti (S1) e (S2), rispettivamente
Un’ulteriore opzione di misurazione puntuale è possibile quando tre piccole diverse regioni circolari del raggio di 10 pixel sono posizionate interattivamente nel campo visivo (Fig. 8). Dovrebbero appartenere alle regioni fogliari con diversi parametri di fluorescenza che picchiettano nel tempo. Tutti i valori di pixel registrati vengono mediati all’interno di queste regioni.