Singola mutazione in una regione altamente conservata del cloramfenicolo acetiltransferasi consente di isobutile acetato di produzione direttamente dalla cellulosa da Clostridium thermocellum a temperature elevate

ceppi Batterici e plasmidi

ceppi Batterici e plasmidi utilizzati in questo studio sono riportati nella Tabella 2. Il ceppo Clostridium thermocellum DSM1313 ∆hpt (M1354) è stato utilizzato come ospite per la produzione di esteri a temperature elevate. Va notato che la delezione del gene della fosforibosiltransferasi ipoxantina (hpt, Clo1313_2927) nel DSM1313 wild-type consente l’ingegneria genetica mediante selezione del contatore 8-azahypoxanthine (8-AZH); questa delezione non ha alcun effetto negativo noto sulla crescita e sul metabolismo cellulare . Il plasmide pNW33N, contenente CATSa, è termostabile ed è stato utilizzato per esprimere vari gatti in C. thermocellum. I plasmidi pET sono stati utilizzati per la clonazione molecolare e l’espressione enzimatica in E. coli.

Prodotti chimici e reagenti

Tutti i prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (MO, USA) e/o Thermo Fisher Scientific (MA, USA), se non specificato altrove. Per la clonazione molecolare, gli enzimi di restrizione e la ligasi T4 sono stati ottenuti da New England Biolabs (MA, USA). Phusion Hot Start II DNA polimerasi è stato utilizzato per la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Media e coltivazione

Per la clonazione molecolare e l’espressione proteica, i ceppi di E. coli sono stati coltivati in brodo di lisogenesi (LB) contenente antibiotici appropriati se non diversamente specificato. Per la caratterizzazione in vivo di CATSa in E. coli, è stato utilizzato un mezzo ibrido M9 con 20 g/L di glucosio. Per la coltura di C. thermocellum, è stato utilizzato il mezzo minimo MTC o il mezzo CTFuD-NY come specificato negli esperimenti. La densità ottica (OD) è stata misurata da uno spettrofotometro a lunghezza d’onda di 600 nm (Spectronic 200+, Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Analisi Multiple Sequence alignment

L’analisi Multiple Sequence Alignment (MSA) è stata eseguita utilizzando MEGA7 . Le sequenze proteiche sono state allineate da ClustalW e visualizzate da ESPript 3.0 (http://espript.ibcp.fr) . Le caratteristiche chiave nelle strutture proteiche di 3U9F, 4CLA e 2XAT sono state estratte rispettivamente da CAT_SALTI, CAT3_ECOLIX e CAT4_PSEAE.

Modellazione molecolare e simulazioni di docking

Strutture tridimensionali (3D)

La struttura 3D di CATSa e alcoli di interesse è stata generata per la prima volta utilizzando Swiss-Model e gli strumenti ‘Builder’ di MOE (Molecular Operating Environment software, versione 2019.01), rispettivamente. La struttura 3D del complesso CATSA a doppio substrato (cioè acetil-CoA-isobutanolo-CATSa) è stata ottenuta estraendo un isobutanolo dal complesso isobutanolo–CATSa e quindi aggiungendolo al complesso acetil-CoA–CATSa. Tutte le strutture sono state preparate dallo strumento ‘QuickPrep’ di MOE con parametri predefiniti e ulteriormente ottimizzate dalla minimizzazione dell’energia con il campo di forza Amber10:EHT.

Docking simulation

Per eseguire simulazioni di docking, è stata cercata la potenziale tasca di binding utilizzando lo strumento ‘Site Finder’ di MOE. Il sito con il punteggio migliore, coerente con i siti catalitici riportati , è stato selezionato per ulteriori studi. Le simulazioni di attracco sono state eseguite come descritto in precedenza . In breve, acetil-CoA e ogni alcol sono stati ancorati utilizzando il protocollo di adattamento indotto con il metodo di posizionamento Triangle Matcher e la funzione di punteggio ΔG di Londra. Dopo le simulazioni di attracco, è stata selezionata la posa di legame con il punteggio migliore, che mostra l’interazione cruciale tra il residuo e il substrato a deviazione radice-media-quadrato (RMSD) < 2 Å. Ad esempio, per il docking acetil-CoA, è stata scelta la posa di legame che mostra il legame idrogeno tra l’idrossile di Ser-148 e l’N71 del CoA . Per l’attracco dell’alcol, è stata selezionata la posa di legame che mostra il legame idrogeno tra l’N3 di His-189 e l’idrossile dell’alcol .

In silico mutagenesi analisi

In silico mutagenesi analisi del complesso acetil-CoA–isobutanolo–CATSa è stata effettuata come precedentemente descritto . In particolare, gli strumenti’ alanine scan ‘e’ residue scan ‘ di MOE sono stati utilizzati per identificare i potenziali residui candidati alla mutagenesi.

Clonazione molecolare

Costruzione plasmidica

I plasmidi sono stati costruiti con la tecnica standard di clonazione molecolare del metodo dipendente dalla ligasi e/o dell’assemblaggio Gibson utilizzando i primer elencati nel file aggiuntivo 1: Tabella S1. I plasmidi costruiti sono stati introdotti in E. coli TOP10 mediante trasformazione da shock termico. Le colonie isolate su una piastra selettiva sono state sottoposte a screening PCR e al plasmide purificato. I plasmidi purificati sono stati verificati tramite sequenziamento Sanger prima di essere trasformati in E. coli BL21 (DE3). La mutagenesi diretta al sito è stata eseguita utilizzando il protocollo di mutagenesi diretta al sito QuickChange™ con lunghezza di sovrapposizione ridotta o metodo di assemblaggio Gibson . Per l’ingegneria C. thermocellum, il plasmide pHS005 è stato costruito prima e poi modificato in pHS0024. pHS0024 non ha hpt a valle dell’operone, mentre altre sequenze del plasmide sono identiche a pHS005.

Trasformazione

I metodi convenzionali di trasformazione chimica e elettroporazione sono stati utilizzati per la trasformazione di E. coli e C. thermocellum , rispettivamente. Per C. thermocellum, il metodo, tuttavia, è stato leggermente modificato come descritto qui. Innanzitutto, C. thermocellum M1354 (Tabella 2) è stato coltivato in 50 ml di terreno CTFuD-NY a 50 °C all’interno di una camera anaerobica (Bactron300, Sheldon manufacturing Inc., O, Stati Uniti D’America). La coltura cellulare con OD in un intervallo di 0,8 – 1,0 è stata raffreddata a temperatura ambiente per 20 min. Oltre questo punto, tutti i passaggi sono stati eseguiti all’esterno della camera. Le celle raffreddate sono state raccolte a 6500×g e 4 °C per 20 min. I pellet di cellule sono stati lavati due volte con acqua Milli-Q raffreddata a ghiaccio e risospesi in 200 µL del tampone di trasformazione costituito da 250 mm di saccarosio e 10% (v/v) di glicerolo. Diverse aliquote di 30 µL delle celle elettrocompetenti sono state immediatamente conservate a-80 °C per un ulteriore utilizzo. Per l’elettroporazione, le cellule elettrocompetenti sono state scongelate su ghiaccio e incubate con 500-1000 ng di plasmidi metilati per 10 min. Quindi, le cellule sono state trasferite in una cuvetta di elettroporazione gap 1-mm raffreddata a ghiaccio (BTX Harvard Apparatus, MA, USA) seguita da due impulsi di decadimento esponenziale consecutivi con 1.8 kV, 350 Ω e 25 µF. Gli impulsi hanno provocato solitamente una costante di tempo di 7.0-8.0 ms. Le cellule sono state immediatamente risospese in CTFuD fresco pre-riscaldato e recuperate a 50 °C in condizioni anaerobiche (90% N2, 5% H2 e 5% CO2) all’interno di un tubo di Balch rivestito in gomma. Dopo 0-12 ore di recupero, le cellule sono state mescolate con un mezzo di agar CTFuD-NY fuso integrato con 15 µg / mL di tiamfenicolo. Infine, la miscela a cellule medie è stata versata su una capsula di petri e solidificata all’interno della camera anaerobica. La piastra è stata incubata a 50 °C fino a 1 settimana fino alla comparsa delle colonie. L’efficienza di trasformazione era di 2-100 unità formanti colonie per plasmide µg (CFU / µg plasmide).

Caratterizzazione in vivo di CATSa e delle sue varianti in E. coli

Per la caratterizzazione in vivo di CATSa e delle sue varianti in E. coli, sono state eseguite colture ad alta densità cellulare come descritto in precedenza con un’aggiunta di 2 g/L di vari alcoli. Per l’estrazione in situ di esteri, ogni tubo è stato sovrapposto con 25% (v/v) esadecano. Per confermare l’espressione proteica di CATSa e delle sue varianti, l ‘ 1% (v/v) delle cellule di riserva è stato coltivato durante la notte a 37 °C e 200 rpm in provette di coltura da 15 mL contenenti 5 ml di mezzo LB e antibiotico. Quindi, il 4% (v/v) delle colture notturne è stato trasferito in 1 ml di mezzo LB contenente antibiotico in una micropiastra a 24 pozzetti. Le colture sono state coltivate a 37 °C e 350 rpm utilizzando un agitatore micropiastra incubatrice (Fisher Scientific, PA, USA) fino a quando OD raggiunto a 0,4–0,6 e poi indotta da 0.1 mm isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) per 4 h con una membrana di tenuta respirabile per prevenire l’evaporazione e la contaminazione incrociata (cat# 50-550-304, Research Products International Corp., IL, USA). I campioni di proteine sono stati ottenuti utilizzando il reagente completo B – PER (cat# 89822, Thermo Scientific, MA, USA), secondo le istruzioni del produttore e analizzati da SDS-PAGE.

Caratterizzazione enzimatica

Purificazione His-tag

Per l’espressione enzimatica, è stata inoculata una coltura overnight con un 1:rapporto 50 in mezzo LB fresco contenente 1 mm IPTG e antibiotico, seguito da 18 ° C durante la notte incubazione (fino a 20 h) in un incubatore agitazione a 200 rpm. Le cellule indotte sono state raccolte per centrifugazione a 4 °C e 4700×g per 10 min. Il pellet cellulare è stato quindi lavato una volta con acqua millipore e risospeso nel reagente completo B-PER. Dopo 30 min di incubazione a temperatura ambiente, la miscela è stata centrifugata a 17.000×g per 2 min. Il surnatante è stato raccolto e designato come estratto grezzo. Per la purificazione di His-tag, l’estratto grezzo è stato incubato con HisPur Ni–NTA superflow agarose in un lotto come raccomanda il produttore. Quindi, la resina è stata lavata con almeno tre volumi di tampone di lavaggio, costituito da 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mm NaCl, 10 mm imidazolo e 0,1 mM EDTA. Le proteine legate alla resina sono state eluite da un tampone di eluizione di 300 µL contenente 50 mm di Tris-HCl (pH 8,0), 50 mm di NaCl, 300 mM di imidazolo e 0,1 mm di EDTA. Il campione eluito è stato quindi dissalato e concentrato tramite una colonna filtrante Amicon con cut-off del peso molecolare di 10 kDa. Infine, il campione proteico è stato sospeso in 200 µL di tampone Tris–HCl da 20 mm (pH 8,0). La concentrazione proteica è stata misurata mediante il test di Bradford con albumina sierica bovina (BSA) come proteina di riferimento.

Thermal shift assay

Per misurare la temperatura di fusione delle proteine (Tm), è stato impiegato un test thermofluor con SYPRO Orange . Circa 10-250 µg di proteina purificata His-tag sono stati mescolati con 5 × SYPRO Orange in un volume finale di 50 µL in una piastra qPCR a 96 pozzetti. La piastra è stata sigillata con tappi PCR prima di eseguire il test. La macchina StepOne real-time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) è stata utilizzata per eseguire il test con i seguenti parametri: ROX reporter, incremento di 1 °C per ciclo, tenuta di 1 min ad ogni ciclo e intervallo di temperatura da 20 a 98 °C. I dati sono stati raccolti, esportati ed elaborati per calcolare Tm.

5,5′-ditiobis-(acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) dosaggio

La velocità di reazione per ciascun GATTO è stata determinata mediante un dosaggio DTNB in una piastra a 384 pozzetti. Il volume totale di reazione è stato di 50 µL con il tampone di reazione composto da 50 mm di Tris-HCl (pH 8,0). Le concentrazioni di acetil-CoA (Coala Biosciences, TX, USA) e alcoli sono state variate come specificato in ogni esperimento. Le concentrazioni finali degli enzimi di 0,05 µg / mL e 10 µg/mL sono state utilizzate per le reazioni verso cloramfenicolo e alcoli, rispettivamente. La cinetica di reazione è stata raccolta misurando l’assorbanza a 412 nm ogni minuto per 1 ora a 50 °C in un lettore di micropiastre (Synergy HTX micropiastre reader, BioTek). La velocità di reazione è stata calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione da una curva standard del coenzima libero A (MP Biomedicals, OH, USA) nella stessa condizione. Va notato che poiché la temperatura massima di esercizio raccomandata per il lettore di piastre è di 50 °C, il test enzimatico ad alto rendimento per CAT a temperature elevate è stato eseguito solo per determinare i parametri cinetici degli enzimi.

Calcolo dei parametri cinetici per le velocità di reazione

I parametri della legge di velocità di Michaelis–Menten (Eq. 1) sono stati calcolati per ciascun enzima come segue. Innanzitutto, la regressione lineare è stata eseguita sui dati raccolti da un lettore di micropiastre per identificare le velocità di reazione iniziali, \(y_{i}\), a diverse concentrazioni iniziali di substrato, \(s_{i}\), dove i = {1,2,…,n} è il numero di punti dati raccolti. Quindi, queste velocità di reazione iniziale e le concentrazioni di substrato iniziali associate per tutte le repliche sono state simultaneamente adattate al modello di Michaelis-Menten (Eq. 1) utilizzando robusta regressione non lineare (Eq. 2) con uno stimatore soft-L1-loss (Eq. 3) come implementato nella libreria di calcolo numerico SciPy v1.2.0 :

Il problema dei minimi quadrati determina i parametri \ (K_ {\text {M}}\) e \(v_{ \text{max} }\) riducendo al minimo la differenza tra le velocità di reazione previste dal modello \(v_ {i}\) e le velocità di reazione misurate \(y_{i}\) (Eq. 2). Una funzione di levigatura \(\rho \ left (z \right)\) viene utilizzata per rendere il problema del minimo quadrato resistente ai valori anomali (Eq. 3). A causa della resistenza imparziale ai valori anomali e dell’evitare errori derivanti dai metodi di linearizzazione convenzionali, la robusta regressione non lineare fornisce la stima dei parametri più precisa per il modello di Michaelis-Menten .

Produzione di acetato di isobutile in C. thermocellum

Fermentazione di Cellobiose

La produzione di acetato di isobutile da cellobiose in ceppi di C. thermocellum è stata eseguita dalla configurazione di bioconversione in due fasi. Le celle in primo luogo sono state coltivate nel medium minimo di MTC che contiene 5 g / L cellobiose in un tubo ricoperto di gomma del Balch fino a OD hanno raggiunto 0.8-1.0. Le celle sono state raffreddate a temperatura ambiente per 20 min e centrifugate a 4700×g e 4 °C per 20 min. Dopo aver rimosso il surnatante, le cellule sono state risospese nello stesso volume di mezzo minimo MTC fresco contenente 2 g/L di isobutanolo in una camera anaerobica. La sospensione cellulare è stata quindi divisa in 800 µL in un tubo di microcentrifuga con tappo a vite da 2,0 mL con sovrapposizione di esadecano da 200 µL. Le cellule sono state incubate a 55 °C per 24 ore, seguite da analisi di gascromatografia accoppiata a uno spettrometro di massa (GC/MS) per quantificare la quantità di acetato di isobutile prodotto.

Fermentazione della cellulosa

Per la fermentazione della cellulosa è stato utilizzato un mezzo MTC modificato (C-MTC medium). 20 g/L di Avicel PH-101 sono stati utilizzati come unica fonte di carbonio invece di cellobiose e 10 g/L di MOP sono stati aggiunti per aumentare la capacità del buffer. pH iniziale è stato regolato a 7,5 da 5 M KOH e autoclavato. In una camera anaerobica, 0,8 ml di coltura cellulare durante la notte sono stati inoculati in 15,2 ml di mezzo C-MTC (rapporto di inoculazione 1:20) con 4 ml di esadecano sovrapposto. Ogni tubo conteneva una piccola barra di agitatore magnetico per omogeneizzare la cellulosa. Il tubo di Balch rivestito in gomma è stato incubato in un bagno d’acqua collegato con un regolatore di temperatura impostato a 55 °C e un sistema di agitazione magnetica. Dopo la regolazione del pH con 70 µL di 5 M di iniezione KOH, 800 µL di coltura cellulare e 200 µL di strato di esadecano sono stati campionati ogni 12 h. Il pH della coltura è stato mantenuto entro un intervallo di 6,4–7,8 durante la fermentazione.

La crescita cellulare è stata monitorata misurando la proteina del pellet. Il pellet di cellulosa cellulare da 800 µL di volumi di campionamento è stato lavato due volte con acqua Milli-Q e sospeso da 200 µL di tampone di lisi (0.2 M NaOH, 1% SDS) seguito da un’ora di incubazione a temperatura ambiente. Quindi, la soluzione è stata neutralizzata con 50 µL 0,8 M HCl e diluita con acqua 550 µL. La miscela è stata centrifugata a 17.000×g per 3 min. La concentrazione proteica del surnatante è stata analizzata dal saggio Bradford compatibile con il detergente (Thermo Scientific, WA, USA). Il pellet residuo è stato bollito in un forno a 98 °C per un’ora prima di quantificare la cellulosa residua.

La cellulosa residua è stata quantificata con il metodo dell’acido fenolo-solforico con alcune modifiche. Il campione bollito è stato lavato due volte con acqua Milli-Q e sospeso in acqua 800 µL per ottenere un volume equivalente all’originale. Il campione è stato omogeneizzato mediante pipettaggio e vortexing per 10 s, e 20 µL del campione omogeneizzato è stato trasferito in una nuova provetta per microcentrifuga da 2,0 mL o piastra a 96 pozzetti e asciugato durante la notte in un forno a 55 °C. Il pellet essiccato è stato sospeso in 200 µL di acido solforico al 95% e incubato per un’ora a temperatura ambiente. Dopo che il pellet è stato completamente sciolto, sono stati aggiunti 20 µL di fenolo al 5% e mescolati con la soluzione di acido solforico. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, 100 µL del campione sono stati trasferiti in una nuova piastra a 96 pozzetti e l’assorbanza a 490 nm è stata misurata. L’assorbanza è stata convertita in concentrazione di cellulosa dalla curva standard di Avicel PH-101 trattata con la stessa procedura.

Metodi analitici

Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

I metaboliti extracellulari sono stati quantificati utilizzando un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (Shimadzu Inc., MD, USA). 800 µL di campioni di coltura sono stati centrifugati a 17.000×g per 3 min, quindi i supernatanti sono stati filtrati attraverso filtri da 0,2 µm e eseguiti con 10 mn di fase mobile H2SO4 a 0,6 mL / min su un Aminex HPX-87H (Biorad Inc., CA, USA) colonna a 50 ° C. Rivelatore di indice di rifrazione (RID) e rivelatore ultravioletto (UVD) a 220 nm sono stati utilizzati per monitorare le concentrazioni di zuccheri, acidi organici e alcoli.

Gascromatografia accoppiata con spettroscopia di massa (GC/MS)

Esteri sono stati misurati da GC (HP 6890, Agilent, CA, USA) dotato di un MS (HP 5973, Agilent, CA, USA). Per il sistema GC, la colonna capillare Zebron ZB-5 (Phenomenex, CA, USA) (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) è stata utilizzata per separare gli analiti e l’elio è stato utilizzato come vettore con una portata di 0,5 mL/min. Il programma di temperatura del forno è stato impostato come segue: temperatura iniziale di 50 °C, rampa di 1 °C/min fino a 58 °C, rampa di 25 °C/min fino a 235 °C, rampa di 50 °C / min fino a 300 °C e bake-out di 2 minuti a 300 °C. 1 µL di strato di esadecano campionato è stato iniettato nella colonna in modalità splitless con una temperatura dell’iniettore di 280 ° C. Per il sistema MS, ione selezionato la modalità (SIM) è stato utilizzato per rilevare e quantificare esteri con i seguenti parametri: (i) acetato di etile, m/z 45.00 e 61.00 da 4.2 a 4.6 min tempo di ritenzione (TR), (ii) acetato di isopropile, m/z 45 e 102 da 4.7 5.0 min RT, (iii) propil acetato, m/z 59 e 73 da 5.2 5.8 min RT, (iv) etil isobutirrato, m/z 73 e 116 da 6.1 a 6.6 min RT, (v) di isobutile acetato, m/z 61 e 101 da 6,6 7,6 min RT, (vi), acetato di butile, m/z 61 e 116 dal 7,7 9,2 min RT, (vii) di isobutile isobutirrato, m/z 89 di 129 da 10.1 a 12.5 min RT, (viii) acetato di benzile, m/z 108 e 150 da 13,1 a 13,8 min RT e (ix) acetato di 2-fenetile, m/z 104 e 121 da 13,8 a 15,5 min RT. Alcol isoamilico e acetato di isoamile sono stati utilizzati come analiti standard interni. Gli esteri sono stati identificati da RT e quantificati dalle aree di picco e dalle curve standard. Le curve standard sono state determinate utilizzando esteri puri diluiti in esadecano a concentrazioni di 0,01 g/L, 0,05 g/L, 0,1 g/L, 0,5 g/L e 1 g/L.