Saggi chip-exo semplificati

Anticorpi

Coniglio IgG (Sigma) coniugato a Dynabeads è stato utilizzato contro ceppi con tag TAP in cui il tag TAP contenente la proteina A era il bersaglio. L’anticorpo millipore 07-729 è stato utilizzato contro campioni K562 mirati a CTCF.

Purificazione Tn5

È stato ordinato un costrutto personalizzato di Tn5 E54K E110K P242A L372P14 in un vettore pET-45b ( + ) (GenScript) per esprimere Tn5 iperattivo con un His6-tag N-terminale. Il plasmide è disponibile presso Addgene (ID Addgene: 112112). BL21(DE3) cellule E. coli competenti (New England Biolabs) sono stati trasformati e una singola colonia è stata coltivata a 37 °C ad un OD600 di 0,4 in 500 ml di LB + 50 µg/ml ampicillina + 30 µg/ml cloramfenicolo. Le cellule sono state trasferite in un incubatore 25 °C e indotte con 0,5 mm isopropil-β-D-galattopiranoside per 4 h. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione, lavate una volta con tampone ST e il pellet cellulare è stato congelato in azoto liquido.

Tn5 è stato purificato come precedentemente descritto10, con poche modifiche. In breve, le cellule sono state risospese in 10 volumi (ml / g) di tampone TEGX100 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0,1% Triton-X 100) contenenti CPI e 100 µM fenilmetilsulfonil fluoruro e lisate per incubazione con lisozima (Sigma; 1 mg / 1 g di pellet cellulare) a temperatura ambiente per 30 min. Il lisato è stato centrifugato a 20.000 × g per 20 min a 4 °C e il surnatante è stato precipitato con 0,25% di polietileneimina (Sigma) e centrifugato a 10.000 × g per 15 min. Il surnatante è stato quindi precipitato con solfato di ammonio di saturazione del 47% (0.28 g/ml) per un’incubazione di 30 minuti, quindi centrifugato a 20.000 × g per 15 minuti.

Il pellet è stato quindi risospeso in 50 ml di tampone di carico per affinità di nichel (50 mm di fosfato di potassio, pH 7,4, 50 mM KCl, 20% glicerolo) e caricato su una colonna HisTrap HP (GE Healthcare; 5 ml) a 1,5 ml/min equilibrato con lo stesso tampone. La colonna è stata lavata in sequenza con tampone di lavaggio I (50 mm fosfato di potassio, pH 7,4, 1 M KCl, 50 mM imidazolo, 20% glicerolo), tampone di lavaggio II (50 mm fosfato di potassio, pH 7.4, 500 mm KCl, 50 mm imidazolo, 20% glicerolo), e poi Tn5 è stato eluito con tampone di eluizione per affinità di nichel (50 mm fosfato di potassio, pH 7,4, 500 mm KCl, 500 mm imidazolo, 20% glicerolo) a 2 ml/min. L’eluato è stato diluito a 300 mm KCl con Tampone di diluizione (50 mm fosfato di potassio, pH 7,4, 20% glicerolo) e il volume finale regolato a 50 ml con tampone TEGX300 (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 0,1% Triton-X 100).

Successivamente, il campione è stato caricato su una colonna HiTrap Heparin HP (GE Healthcare; 1 ml) bilanciata con TEGX300 a 1 ml/min. Dopo il lavaggio con 5 volumi di tampone a colonna, è stato eseguito un gradiente NaCl lineare da 10 ml (da 300 mm a 1,2 M) per eluire. Tn5 eluito dalla colonna a circa 600 mm NaCl. Frazioni, contenenti il principale picco di eluizione sono stati combinati (3,5 ml) e dialyzed notte contro TEGX300 Buffer contenente il 30% di glicerolo, e conservato a -80 °C.

Lievito di cromatina preparazione

TAP-tag ceppi di Saccharomyces cerevisiae (Aperto Biosystems) sono state coltivate in 500 ml di lievito peptone destrosio media per un OD600 = 0.8 a 25 °C. Le cellule sono state reticolate con formaldeide ad una concentrazione finale dell ‘ 1% per 15 min a temperatura ambiente e spente con una concentrazione finale di 125 mm di glicina per 5 min. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione e lavate in 1 ml di tampone ST (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mm NaCl) a 4 °C e divise in due aliquote. Le cellule sono state pellettate di nuovo, il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato congelato.

Un’aliquota di coltura da 250 ml è stata lisata in 750 µl di tampone di lisi (50 mm Hepes-KOH, pH 7,5, 150 mm NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton, 0.1% di sodio desossicolato, e CPI) e 1 ml di volume di 0,5 mm zirconia/perle di silice da Beadbeater battere in un Mini-Beadbeater-96 macchina (Biospec) per tre cicli di 3 min on/5 min off cicli (campioni sono stati tenuti sul ghiaccio durante il ciclo off). Il lisato è stato trasferito in un nuovo tubo e microcentrifugato alla massima velocità per 3 min a 4 °C per pellet la cromatina. Il surnatante è stato scartato e il pellet è stato risospeso in 750 µl di tampone di lisi integrato con SDS allo 0,1% e trasferito in un tubo conico di polistirene da 15 ml. Il campione è stato quindi sonicato in un Bioruptor (Diagenode) per 15 cicli con intervalli on/off di 30 s per ottenere frammenti di DNA di dimensioni da 100 a 500 bp. Un test ChIP-exo ha elaborato l’equivalente di 50 ml di coltura cellulare (~6 × 108 cellule). Questo rappresenta un importo conveniente piuttosto che un importo minimo necessario.

K562 preparazione di cromatina

Le cellule di leucemia mieloide cronica umana (K562, ATCC) sono state mantenute tra 1 × 105 e 1 × 106 cellule/ml in mezzi DMEM integrati con siero bovino fetale al 10% a 37 °C con 5% di CO2. Le celle sono state lavate con PBS (8 mm Na2HPO4, 2 mm KH2PO4, 150 mm NaCl e 2,7 mM KCl), quindi reticolate con formaldeide ad una concentrazione finale dell ‘ 1% per 10 min a temperatura ambiente e spente con una concentrazione finale di 125 mM glicina per 5 min. Il surnatante è stato rimosso e le cellule sono state risospese in 1 ml di PBS per il lavaggio. Le cellule sono state aliquote per contenere 100 milioni di cellule, centrifugate, il surnatante è stato rimosso e il pellet è stato congelato.

Un’aliquota di 100 milioni di cellule (da utilizzare in più CHIP) è stata lisata in 500 µl (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mm NaCl, 0.5% NP40 e inibitore completo della proteasi (CPI, Roche)) incubando su ghiaccio per 10 min. Il lisato è stato microcentrifugato a 2500 giri / min per 5 min a 4 °C. Il surnatante è stato rimosso, il pellet risospeso in 1 ml (50 mM Tris-pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.32% SDS e CPI) e incubato su ghiaccio per 10 min per lisare i nuclei. Il campione è stato diluito con 600 µl di tampone di diluizione per immunoprecipitazione (tampone di diluizione IP: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 e CPI) ad una concentrazione finale di (40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 7 mM EDTA, 56 mM NaCl, 0,4% Triton-X 100, 0.2% SDS, e CPI), e sonicato con un Bioruptor (Diagenode) per 10 cicli con 30 s on/off intervalli per ottenere frammenti di DNA 100 a 500 bp di dimensione.

Preparazione del tessuto del topo

I tessuti del topo maschio adulto di 16 settimane sono stati generosamente forniti dal Dr. Yanming Wang I tessuti del topo sono stati elaborati a 100 mg e la cromatina è stata generata come precedentemente descritto21 con piccole modifiche. In breve, 100 mg di tessuto murino sono stati macinati a pezzi su ghiaccio, fissati con 1% di formaldeide per 10 min, e quindi spenti con una concentrazione finale di 125 mm di glicina per 5 min. Le cellule sono state filate, lavate con PBS e poi risospese in 1 ml di tampone di lisi cellulare di Farnham freddo (20 mm Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 0,5% Triton X-100 e CPI). Le cellule sono state quindi incubate su un rototorque per 20 min a 4 C. I nuclei isolati sono stati isolati da spun down e risospesi in tampone di lisi nucleare RIPA (1 × PBS, 1% NP-40, 0,5% NaDeossicolato, 0,5% SDS e CPI). I nuclei sono stati quindi sonicati con un Bioruptor (Diagenode) per 10 cicli con intervalli on/off di 30 s per generare DNA nell’intervallo di grandezza di 100-500 bp. Il numero di cellule epatiche è stato stimato come descritto in precedenza22, utilizzando un fattore di conversione di 1 mg di peso umido del tessuto pari a ~250.000 cellule.

Immunoprecipitazione della cromatina

Un 50 ml di coltura equivalente di lievito o 10 milioni di cellule equivalenti di cromatina K562 è stato diluito a 200 µl con tampone di diluizione IP e incubato durante la notte a 4 °C con l’anticorpo appropriato. Ai campioni di lievito è stato aggiunto un volume letto di 10 µl di IgG-Dynabeads; e 3 µg di anticorpo anti-CTCF con un 10 µl slurry-equivalente di proteina A Mag Sepharose (GE Healthcare) è stato aggiunto ai campioni K562.

ChIP-exo 1.1

ChIP-exo 1.1 è stato eseguito come precedentemente descritto7,8, 23. In breve, le seguenti fasi enzimatiche sono state eseguite con cromatina immunoprecipitata ancora sulla resina con più lavaggi di sale tra ogni fase: T4 DNA polimerasi fine lucidatura, T4 polinucleotide chinasi, Klenow frammento A-tailing, T4 DNA ligasi-mediata Read_2 adattatore legatura, phi29 DNA polimerasi fill-in, seconda T4 polinucleotide chinasi, lambda esonucleasi digestione, e recjf esonucleasi digestione. Dopo il trattamento overnight reverse cross-linking e Proteinase K, i seguenti passaggi sono stati eseguiti in soluzione: estensione del primer phi29, secondo frammento di Klenow A-tailing, legatura dell’adattatore Read_1 mediata da DNA ligasi T4 e PCR.

ChIP-exo 3.0 e 3.1 (versione basata su tagmentation)

Dopo l’immunoprecipitazione, sono stati eseguiti i seguenti passaggi sulla resina. Per assemblare la trasposasi, il Tn5 è stato incubato in una miscela di 10 × transposasi contenente i seguenti componenti e incubato per 30 min a temperatura ambiente: 12,5 µM di Tn5, 50% di glicerolo e adattatore da 7,5 µM (NexA2/ME comp). Vedere la Tabella supplementare 1 per le sequenze di oligonucleotidi utilizzate in questo studio.

Il materiale del chip su resina è stato lavato in sequenza con tampone di lisi, tampone NaCl (50 mm HEPES-KOH, pH 7,5, 500 mm NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% di sodio desossicolato), LiCl Buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 500 mM LiCl, 1% NP-40, 1% di sodio desossicolato), e 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C.

Il tagmentation reazione (30 µl) contenente: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 10% dimetilformammide, e 1 × Tagmentation Mix dal punto 1 (concentrazione finale: 1.25 µM Tn5, 5% glicerolo, 750 nM adattatore) è stato incubato per 30 min a 37 °C. dopo l’incubazione, la resina è stata lavata due volte con Guanidina Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM guanidina, 2 mM EDTA, 1% Triton-X 100, 0.1% di sodio desossicolato) per 5 min a 37 °C, quindi con LiCl Buffer e 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C.

fill-in di reazione (30 µl) contenente: 10 U phi29 polimerasi (NEB), 1 × phi29 reazione buffer (NEB), 2 × (200 µg/ml di BSA, e 165 µM dNTPs è stata incubata per 20 min a 30 °C; quindi lavate con Tris-HCl 10 mM, pH 8.0 a 4 °C. La chinasi di reazione (30 µl) contenente: 10 U T4 PNK (NEB), 1 × T4 DNA Ligasi Buffer (NEB), e 2 × BSA è stata incubata per 15 min a 37 °C, quindi lavato con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Il λ exonuclease di digestione (100 µl) contenente: 20 U λ exonuclease (NEB), 1 × λ exonuclease reazione buffer (NEB), 0.1% Triton-X 100, e il 5% di DMSO è stato incubato per 30 min a 37 °C, quindi lavato con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Il RecJf exonuclease di digestione (100 µl), contenente: 75 U RecJf exonuclease (NEB), 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton-X 100, e il 5% di DMSO è stato incubato per 30 min a 37 °C; poi lavato con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C.

DNA è stato eluito dalla resina, e inverso di cross-linking e Proteinasi K il trattamento è stato eseguito (40 µl), contenente: 30 µg Proteinasi K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mm NaCl e 0,5% SDS incubati per 16 ore a 65 °C. Il surnatante è stato quindi trasferito in un nuovo tubo e purificato con perline magnetiche Agencourt AMPure (Beckman Coulter) seguendo le istruzioni del produttore e utilizzando 1,8 × volume di liquame AMPure aggiunto al volume di DNA (72 µl).Il campione è stato eluito dalle perle di AMPure in 10 µl di acqua e le seguenti fasi enzimatiche sono state eseguite in soluzione.

Legatura adattatore (versione 3.0): per la reazione di estensione del primer (volume totale di reazione 20 µl); al campione risospeso è stato aggiunto 1 × tampone di reazione phi29, 2 × BSA, 100 ΜM dNTPs e 0,5 µM ME oligonucleotide di sequenza (totale 9 µl) e incubato per 5 min a 95 °C, quindi 10 min a 45 °C per consentire al tempo di oligo di ricottura. Il campione è stato spostato a 30 ° C prima di aggiungere 10 U phi29 polimerasi (1 µl) e incubare per 20 min a 30 ° C; quindi per 10 min a 65 ° C per inattivare e spostato a 37 °C.

Per la reazione di A-tailing (volume di reazione totale 30 µl); di primer extension reazione è stata aggiunta 10 U Frammento di Klenow, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, 100 µM dATP (totale 10 µl) e incubate per 30 min a 37 °C, quindi per 20 min a 75 °C per inattivare, e spostato a 25 °C. Per la seconda scheda, legatura reazione (reazione totale volume 40 µl); a-tailing reazione è stata aggiunta 2.000 U T4 DNA ligasi (enzimatici), 1 × NEBNext Rapida Legatura Buffer (NEB), 375 nM adattatore (ExA1-58/13) e incubate per 1 h a 25 °C.

Stecca di legatura (versione 3.1): per l’adattatore di legatura (40 µl); al DNA risospeso è stato aggiunto 1.200 U T4 DNA ligasi, 1 × T4 DNA Ligasi Buffer, adattatore 375 nM (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) e incubato per 1 h a 25 °C.

Sia versione 3.0 che 3.1: la reazione di legatura è stata quindi purificata con perle di AMPure e risospesa in 15 µl di acqua. Il campione è stato poi amplificato tramite PCR. Per l’amplificazione della PCR( volume totale di reazione 40 µl); al DNA risospeso è stata aggiunta 2 U Phusion polimerasi Hot Start (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM ciascun primer (P1.3 e NexA2-iNN) e amplificato per 18 cicli (20 s a 98 °C denatura, 1 min a 52 °C ricottura, e 1 min a 72 °C estensione). Un quarto della reazione è stato amplificato per altri sei cicli (24 totali) e la presenza di librerie è stata determinata mediante elettroforesi su un gel di agarosio al 2%.

Selezione del formato :200-500 prodotti bp PCR sono stati purificati in gel da un gel di agarosio al 2% utilizzando il QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

ChIP-exo 4.0 e 4.1 (versioni di legatura del DNA a filamento singolo)

Dopo l’immunoprecipitazione, sono stati eseguiti i seguenti passaggi sulla resina. Il ChIP materiale resina è stata lavata in sequenza con FA Tampone di Lisi, NaCl Buffer, LiCl Buffer, e 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Alla fine la riparazione di reazione (50 µl), contenente: 7.5 U T4 DNA polimerasi (NEB), 2,5 U DNA Polimerasi I (NEB), 25 U T4 PNK, 1 × T4 DNA Ligasi Buffer, e 390 µM dNTPs è stata incubata per 30 min a 12 °C; quindi lavate con Tris-HCl 10 mM, pH 8.0 a 4 °C. Il λ exonuclease di digestione (100 µl)contenente: 20 U λ esonucleasi, 1 × λ exonuclease reazione buffer, 0.1% Triton-X 100, e il 5% di DMSO è stato incubato per 30 min a 37 °C, quindi lavato con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Il RecJf exonuclease di digestione (100 µl), contenente: 75 U RecJf esonucleasi, 2 × NEBuffer 2, 0.1% Triton-X 100, e il 5% di DMSO swas incubate per 30 min a 37 °C, quindi lavato con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C.

Prima scheda legatura: ssDNA legatura (versione 4.0, 40 µl): per adapterion legatura 1200 U T4 DNA ligasi, 1 × T4 DNA Ligasi Buffer, e 375 nM a singolo filamento adattatore (ExA1-58-N5) è stata incubata per 1 h a 25 °C; quindi lavate con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C.

Stecca di legatura (versione 4.1, 40 µl): 1200 U T4 DNA ligasi, 1 × T4 DNA Ligasi Buffer, e 375 nM adattatore (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) è stata incubata per 1 h a 25 °C; quindi lavate con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C.

Sia la versione 4.0 e 4.1: il DNA è stato eluito dalla resina, e inverso di cross-linking e Proteinasi K il trattamento è stato eseguito (40 µl), contenente: 30 µg Proteinasi K, 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM EDTA, 200 mM NaCl, e lo 0,5% SDS incubate per 16 h a 65 °C.

Il surnatante è stato quindi trasferito in un nuovo tubo e purificato con perline magnetiche Agencourt AMPure (Beckman Coulter) seguendo le istruzioni del produttore (1,8 × volume). Il campione è stato eluito dalle perle di AMPure in 20 µl di acqua e le seguenti fasi enzimatiche sono state eseguite in soluzione.

Secondo adattatore legatura: SSDNA legatura (versione 4.0, volume totale di reazione 40 µl) : al DNA risospeso è stato aggiunto 1200 U T4 DNA ligasi, 1 × T4 DNA Ligasi Buffer, 375 nM adattatore (ExA2.1-N5/ExA2.1-20) ed è stato incubato per 1 h a 25 °C.

Legatura dell’adattatore Splint (versione 4.1, volume totale di reazione 40 µl): al DNA risospeso sono state aggiunte 1200 U T4 DNA ligasi, 1 × T4 DNA Ligasi Buffer, adattatore 375 nM (ExA1-58/ExA1-SSL_N5) ed è stato incubato per 1 ora a 25 °C.

Sia versione 4.0 che 4.1: la reazione di legatura con perle di AMPure (1,8 × volume) e risospese in 15 µl di acqua. Il campione è stato poi amplificato tramite PCR. Per l’amplificazione PCR (volume totale di reazione 40 µl); al DNA risospeso sono state aggiunte 2 polimerasi Hot Start U Phusion (Thermo scientific), 1 × Tampone HF Phusion (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM ogni primer (P1.3 e NexA2-iNN) e amplificate per 18 cicli (20 s a 98 °C denatura, 1 min a 52 °C ricottura, 1 min a 72 °C estensione). Un quarto della reazione è stato amplificato per altri sei cicli (24 totali) e la presenza di librerie è stata determinata mediante elettroforesi su un gel di agarosio al 2%. Selezione del formato: i prodotti da 200 a 500 bp PCR sono stati purificati in gel da un gel di agarosio al 2% utilizzando il QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Nota: ChIP-exo 4.0/4.1 ha incorporato un adattatore Read_2 universale, con il codice a barre aggiunto in seguito durante la PCR con primer lunghi. Ogni volta che i primer PCR lunghi venivano utilizzati in una costruzione di librerie che coinvolgeva la digestione dell’esonucleasi lambda, le librerie soffrivano di bassa resa e alti dimeri dell’adattatore. Ora usiamo solo adattatori a tutta lunghezza e primer PCR di lunghezza minima.

ChIP-exo 5.0

Dopo l’immunoprecipitazione, sono stati eseguiti i seguenti passaggi sulla resina. Il ChIP materiale resina è stata lavata in sequenza con FA Tampone di Lisi, NaCl Buffer, LiCl Buffer, e 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Per l’A-tailing reazione (50 µl), contenente: 15 U Frammento di Klenow, -exo (NEB), 1 × NEBuffer 2, e 100 µM dATP è stata incubata per 30 min a 37 °C, quindi lavato con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Il primo adattatore legatura e la chinasi di reazioni (45 µl) contenente: 1200 U T4 DNA ligasi, 10 U T4 PNK, 1 × NEBNext Rapida Legatura Buffer, e 375 nM adattatore (ExA2_iNN / ExA2B) è stata incubata per 1 h a 25 °C; quindi lavate con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Il fill-in di reazione (40 µl) contenente: 10 U phi29 polimerasi, 1 × phi29 reazione buffer, 2 × BSA, e 180 µM dNTPs è stata incubata per 20 min a 30 °C; quindi lavate con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C. Il λ exonuclease di digestione (50 µl) contenente: 10 U λ esonucleasi, 1 × λ exonuclease reazione buffer, 0.1% Triton-X 100, e il 5% di DMSO è stato incubato per 30 min a 37 °C; poi lavato con 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 a 4 °C.

DNA è stato eluito dalla resina, e inverso di cross-linking e Proteinasi K il trattamento è stato eseguito (40 µl) contenente: 30 µg Proteinasi K, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 200 mm NaCl e 0,5% SDS incubati per 16 ore a 65 °C. Il surnatante è stato quindi trasferito in un nuovo tubo e purificato con perline magnetiche Agencourt AMPure (Beckman Coulter) seguendo le istruzioni del produttore (1,8 × volume).Il campione è stato eluito dalle perle di AMPure in 20 µl di acqua e le seguenti fasi enzimatiche sono state eseguite in soluzione. Per la seconda legatura dell’adattatore (volume totale di reazione 40 µl): al DNA risospeso è stato aggiunto 1200 U T4 DNA ligasi, 1 × T4 DNA Ligasi Buffer, adattatore 375 nM (ExA1-58 / ExA1-SSL_N5) ed è stato incubato per 1 h a 25 °C. La reazione di legatura è stata quindi purificata con perle di AMPure (1,8 × volume) e risospesa in 15 µl di acqua.

Il campione è stato quindi amplificato tramite PCR. Per l’amplificazione PCR (volume totale di reazione 40 µl); al DNA risospeso è stata aggiunta 2 U Phusion polimerasi Hot Start (Thermo scientific), 1 × Phusion HF Buffer (Thermo scientific), 200 µM dNTPs, 500 nM ogni primer (P1.3 e P2.1) e amplificato per 18 cicli (20 s a 98 °C denatura, 1 min a 52 °C ricottura, 1 min a 72 °C estensione). Un quarto della reazione è stato amplificato per altri sei cicli (24 totali) e la presenza di librerie è stata determinata mediante elettroforesi su un gel di agarosio al 2%. Selezione del formato: i prodotti da 200 a 500 bp PCR sono stati purificati in gel da un gel di agarosio al 2% utilizzando il QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Nota: abbiamo scoperto che l’utilizzo di un metodo diverso dalla purificazione del gel in questa fase porta a un livello inaccettabilmente elevato di dimeri dell’adattatore nel campione finale. La purificazione del gel può separare efficacemente il dimero dell’adattatore (frammento 150 bp) e frammenti più piccoli della libreria ChIP-exo (frammento 200 bp = adattatori 150 bp + inserto 50 bp).

Sequenziamento del DNA

Il sequenziamento del DNA ad alto throughput è stato eseguito con un NextSeq 500 in modalità accoppiata-end producendo 2 × 40 letture bp. Le letture di sequenza sono state successivamente allineate ai genomi di lievito (sacCer3) e umano (hg19) utilizzando bwa-mem (v0.7.9 a)24. Le letture allineate sono state filtrate per rimuovere allineamenti non univoci e duplicati PCR. I duplicati PCR sono stati definiti come letture di sequenza che possiedono sequenze Read_1 e Read_2 identiche.

Disponibilità dei dati

Tutti i file di sequenziamento e i file di picco di questo studio sono disponibili presso NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sotto i numeri di adesione GSE110681 e GSE114606. I file di coordinate, i parametri di script e il codice personalizzato utilizzato per generare le cifre di questo documento possono essere scaricati da: https://github.com/CEGRcode/2018-Rossi_NatureCommunications.

Tutti gli altri dati sono disponibili presso gli autori su ragionevole richiesta.