Il test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un metodo importante per il monitoraggio della regolazione trascrizionale con conoscenza scoperta delle interazioni tra proteine specifiche e una regione del DNA genomico. Dato che le proteine che legano il DNA (compresi i fattori di trascrizione e gli istoni) nelle cellule viventi possono essere reticolate al DNA che si legano, ChIP viene utilizzato per immunoprecipitare il complesso proteina-DNA dai lisati cellulari da un anticorpo appropriato. I complessi immunoprecipitati vengono raccolti mediante centrifugazione e le proteine vengono eluite per ulteriori analisi come western blot e LC/MS. L’analisi dell’acido nucleico viene ottenuta attraverso PCR, RT-PCR, sequenziamento cDNA e microarray. Questo protocollo fornisce una procedura dettagliata per ottenere il test del CHIP di successo in modo veloce ed efficiente.
Reagenti:
- 37% formaldeide
- 1 M glicina
- Tampone di lisi cellulare: 150 mm NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mm EDTA, 0,5% NP-40, 1% Triton X-100, con 1× cocktail inibitore della proteasi.
- PBS: pH 7.4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4.
- 10% Chelex 100
Equipments:
- Sonicator
- Ultrasonic bath
- Rocking or shaking device
- Eppendorf tube rotator
- Refrigerated microcentrifuge
- Gel electrophoresis apparatus
- PCR apparatus
Steps:
Cross-link and cell collection
1. Aggiungere 27 µL 37% di formaldeide per mezzo di coltura da 1 mL per ottenere una concentrazione finale all ‘ 1%, incubare le cellule per 10 min a temperatura ambiente agitando lentamente su un dispositivo oscillante o scuotente.
2. Quench cross-link aggiungendo 141 µL 1 M glicina per 1 mL terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale a 125 mm, incubare le cellule per 5 min a temperatura ambiente.
3. Per celle galleggianti: inserire le celle in un tubo conico da 15 ml, centrifugare a 2.000 × g a 4°C per 5 min. Eliminare il surnatante e lavare le cellule due volte con PBS freddo.
Vai al passaggio 5.
4. Per le cellule adesive: rimuovere il mezzo, lavare le cellule due volte con PBS freddo. Raschiare le cellule in PBS in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 2.000 × g a 4°C per 5 min.
Lisi e sonicazione
5. Eliminare il surnatante, aggiungere 1 ml di tampone di lisi a cellule fredde per 1 × 107 cellule. Risospendere il pellet pipettando su e giù per diverse volte e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
6. Sonicate per tagliare la cromatina in un frammento di 0,5 ~ 1 kb. Evitare la schiuma e tenere il campione sul ghiaccio.
Note:
- Le condizioni di sonicazione devono essere ottimizzate in base al campione e al modello del sonicatore. In genere, sei impulsi di 15 secondi seguiti da periodi di riposo di 45 secondi all’uscita 6.0 sono stati trovati a funzionare. Per l’analisi della dimensione del frammento, estrarre un piccolo volume di DNA totale da un’aliquota di cromatina tranciata e quindi analizzare su un gel di agarosio (1~2%).
- Si suggerisce che i volumi siano ≤ 1 mL per mantenere l’efficienza della sonicazione.
7. Centrifugare a 12.000 × g a 4°C per 10 minuti e trattenere il surnatante.
8. Trasferire 0,5 mL di surnatante in un nuovo 1.Provetta da 5 mL per l’analisi dei frammenti di DNA.
Immunoprecipitazione
9. Aggiungere anticorpi rilevanti o IgG normali al campione e incubare per 15 min in un bagno d’acqua ad ultrasuoni a temperatura ambiente.
Note:
- Scegli IgG dalla stessa specie in cui sono stati prodotti gli anticorpi.
- Il tempo di incubazione dovrebbe essere ottimizzato dipende dall’anticorpo e dall’antigene. Per gli antigeni con un basso livello di espressione, l’incubazione potrebbe essere eseguita a 4°C durante la notte su una piattaforma rotante .
10. Preparare proteine A-perle di agarosio: lavare le perle tre volte con 1 ml di tampone di lisi (senza inibitore della proteasi), centrifugare a 2000 × g per alcuni secondi a 4°C e quindi eliminare il surnatante.
11. Diluire le perle 1:1 con tampone di lisi e aggiungere 50 µL al campione.
12. Incubare a 4°C per 30~45 min in una piattaforma rotante.
13. Centrifugare a 2000 × g per 1 min a 4°C e quindi eliminare il surnatante.
14. Lavare le perle per quattro volte con 1 ml di tampone di lisi (senza inibitore della proteasi), eliminare il surnatante.
Purificazione e analisi del DNA
15. Risospendere le perle lavate con 100 µL 10% Chelex 100.
16. Pipettare su e giù per diversi secondi, quindi far bollire il campione per 10 minuti.
17. Centrifugare a 12.000 × g per 1 min a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in una provetta fresca da 1,5 ml.
18. Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione del DNA o con il protocollo standard di estrazione del fenolo: cloroformio.
19. Sciogliere il DNA con 50 µL ddH2O e utilizzare 2~10 µL del campione di DNA (25% del volume di reazione) nelle reazioni PCR
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