Materiali e metodi
Dopo aver ricevuto il consenso informato scritto dai pazienti, abbiamo esaminato la farmacocinetica allo steady-state della clonidina somministrata per via orale nel plasma di 17 donne in gravidanza che ricevevano clonidina durante la metà della gravidanza (22-26 settimane di gestazione) o la gravidanza tardiva (34-38 settimane di gestazione). Sei di queste donne hanno partecipato alla raccolta di campioni di plasma materno e del cordone ombelicale (arterioso e venoso) al momento del parto per la misurazione delle concentrazioni di clonidina. L “età gestazionale si basava sull” ultimo periodo mestruale o ecografia precoce incontri.
Selezione del soggetto. Questo studio è stato approvato dall’Università di Washington Investigational Review Board. I soggetti erano idonei a partecipare se erano in stato di gravidanza, 18 anni di età, avevano un ematocrito ≥28% e ricevevano clonidina orale per ipertensione materna.
Regime posologico. La terapia con clonidina orale non è stata alterata ai fini dello studio. I dosaggi variavano da 0,15 a 0,30 mg al giorno, somministrati in dosi divise. La durata dello studio farmacocinetico dipendeva dall’intervallo di dosaggio del soggetto, che variava da 6 a 12 h. Per 3 giorni prima dello studio, sono state fornite compresse di clonidina orale, dello stesso lotto di produzione. I soggetti hanno registrato il tempo di ciascuna dose in un calendario di studio. I soggetti hanno assunto la dose di clonidina mattutina entro 30 minuti dalle 8:00 del mattino. Le dosi successive sono state assunte entro 30 minuti dai tempi di somministrazione previsti. La mattina dello studio di farmacocinetica, ai soggetti è stato chiesto di digiunare, ad eccezione dei liquidi limpidi, per 5 ore prima della somministrazione di clonidina fino a 1 ora dopo la somministrazione.
Raccolta di campioni. I campioni seriali di plasma sono stati raccolti nei seguenti momenti: 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, e 12 h postdosing, o troncato per corrispondere all’intervallo di dosaggio del soggetto. L’urina è stata raccolta in un intervallo di somministrazione per determinare la clearance renale della clonidina e la clearance della creatinina. Campioni di plasma, materno e cordone ombelicale (arterioso e venoso), sono stati raccolti al momento del parto per quantificare le concentrazioni di clonidina. Tutti i campioni sono stati conservati a -80°C fino all’analisi del campione.
Concentrazioni di clonidina. Le concentrazioni plasmatiche di clonidina sono state quantificate utilizzando un test convalidato di cromatografia liquida/spettrometria di massa (LC/MS). In breve, 250 µl di campioni di plasma sono stati miscelati con 500 pg di standard interno (clonidina-d4) in 500 µl di carbonato di sodio (0,1 M) (pH = 9,3) e 3 ml di eptano/alcool isoamilico (98,5:1,5). Gli standard sono stati preparati spiking plasma bianco con 0, 12.5, 25, 50, 100, 200, 250, 375, 500, e 750 pg di clonidina. I campioni sono stati agitati su uno shaker orizzontale per 15 min a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione (1500g per 10 min), i campioni sono stati congelati su ghiaccio secco e lo strato organico decantato in un tubo di coltura pulito. Due millilitri di aliquote di acido solforico (0,05 M) sono stati aggiunti allo strato organico e nuovamente agitati per 15 min. Dopo la centrifugazione (1500g per 10 min), i campioni sono stati congelati su ghiaccio secco e lo strato organico è stato scartato. Un’aliquota di 200 µl di 29.L’idrossido di ammonio acquoso al 29% è stato aggiunto allo strato acquoso insieme a 3 ml di alcol eptano/isoamilico (98,5:1,5) e agitato per 15 min. Dopo la centrifugazione (1500g per 10 min), i campioni sono stati congelati su ghiaccio secco e lo strato organico decantato in un tubo di coltura pulito. Lo strato organico è stato evaporato sotto una corrente di azoto a 40 ° C. Il residuo è stato ricostituito con 75 µl di acido formico (12 mm)/metanolo (60:40), 10 µl dei quali sono stati iniettati nel sistema LC/MS.
Campioni di urina di 250 µl sono stati miscelati con 250 µl di acido formico (12 mm) e 50 ng di standard interno (clonidina-d4). Gli standard sono stati preparati con l’aggiunta di urina bianca con 0, 1.25, 2.5, 6.25, 12.5, 18.75, e 25 ng di clonidina, rispettivamente. I campioni sono stati vortexati e 1 µl è stato iniettato sul LC / MS.
Il sistema LC / MS era un Agilent 1100 MSD (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) costituito da pompa binaria, autocampionatore, vano colonna e spettrometro di massa. La colonna di cromatografia liquida ad alte prestazioni era un Phenomenex Synergi Polar RP80A, 250 mm × 2.0 mm, 4 µm (Phenomenex, Torrance, CA). La colonna è stata mantenuta a 40°C. I componenti in fase mobile erano 12 mm di acido formico (A) e metanolo (B), con una portata iniziale di 0,25 ml/min. La fase mobile iniziale è stata mantenuta per 1 min e consisteva nel 40% B per i campioni di plasma e nel 35% B per i campioni di urina. La percentuale di B è stata aumentata linearmente nei 4 minuti successivi al 90% per il plasma e al 60% per l’urina e quindi mantenuta costante per 1 min con un aumento del flusso lineare a 0,3 ml/min per l’urina e il plasma. Per il gradiente di ritorno, la percentuale di B è stata quindi diminuita linearmente su 1 min al 40% (plasma) o al 35% (urina), che è stata quindi mantenuta costante. La portata è stata mantenuta a 0,3 ml / min per 1 min e quindi diminuita linearmente su 1 min a 0,25 ml / min e quindi mantenuta costante. Il tempo di esecuzione totale è stato di 12,5 min. Per entrambi i test plasma e urina, lo spettrometro di massa è stato azionato in modalità elettrospray positivo e impostato per il monitoraggio selettivo degli ioni di m / z 230 (clonidina) e m/z 236 (clonidina-d4) con tempo di permanenza di 289 msec per ogni ion.
Parametri farmacocinetici. I parametri farmacocinetici allo steady-state sono stati determinati utilizzando tecniche non componenti standard. L’area sotto la curva concentrazione-tempo della clonidina plasmatica su un intervallo di dosaggio (AUCt) è stata calcolata utilizzando la regola trapezoidale lineare. La clearance orale apparente (CL / F) è stata calcolata in base a CL/F = Dose/AUCt. La clearance renale della clonidina (CLrenal) è stata calcolata da CLrenal = Ae,τ/AUCt, dove Ae,τ = la quantità di clonidina escreta immodificata nelle urine in un intervallo di somministrazione. La clearance della creatinina è stata calcolata da CrCl = (VolumeUrina × CreatinineUrina)/(CreatinineSerum× τ). La clearance renale della clonidina aggiustata per la velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è stata calcolata da CLrenal aggiustato per GFR = CLrenal – fu × CrCl, dove la frazione non legata nel plasma (fu) è stata assunta come 0,80 (Hulter et al., 1979). In tutti i nostri soggetti, l’intervallo di dosaggio relativamente breve non ha permesso una stima accurata dell’emivita della clonidina, che è stata precedentemente riportata come 11,1 ± 3,3 e 10,8 ± 2,2 h in adulti sani non gravidi (Cunningham et al., 1994; Fujimura et al., 1994).
Statistiche. I nostri parametri farmacocinetici della clonidina in gravidanza sono stati confrontati con i parametri precedentemente pubblicati in volontari sani e non in gravidanza (CL/F, Porchet et al., 1992; Cunningham et al., 1994) (CLrenal, Fujimura et al., 1994). La regressione lineare è stata utilizzata per determinare la correlazione tra clearance della creatinina e clearance renale della clonidina. Il test t dello studente spaiato è stato utilizzato per confrontare i gruppi in gravidanza e non in gravidanza. Un valore p < 0,05 è stato considerato significativo. Tutti i risultati sono riportati come media ± S. D.