Canali di cloruro | Anne Marie

descrizione: il Cloruro di canali sono funzionalmente e strutturalmente diversi gruppi di anione selettivo canali coinvolti in processi, tra cui la regolazione dell’eccitabilità dei neuroni, scheletrico, cardiaco e liscio muscolare, regolazione del volume cellulare, transepiteliale trasporto del sale, l’acidificazione degli interni e compartimenti extracellulari, il ciclo cellulare e l’apoptosi (rivisto da Nilius e Droogmans, 2003). Escludendo i recettori GABA e glicina transmitter-gated (vedi tabelle separate), i canali del cloruro ben caratterizzati possono essere classificati come alcuni membri della sottofamiglia CLC sensibile alla tensione, canali attivati dal calcio, canali di conduttanza ad alta (maxi), il regolatore di conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) e canali regolati dal volume (Verkman e Galietta, 2009). Non esiste alcuna raccomandazione ufficiale per quanto riguarda la classificazione dei canali del cloruro. Sono elencati i canali funzionali del cloruro che sono stati clonati o caratterizzati all’interno dei tessuti dei mammiferi.

ClC-famiglia: Il mammifero ClC famiglia (rivisto da Nilius e Droogmans, 2003; Chen, 2005; Dutzler, 2007; Jentsch, 2008) contiene nove membri che rientrano in tre gruppi; ClC-1, ClC-2, hClC-Ka (rClC-K1) e hClC-Kb (rClC-K2); ClC-3 di ClC-5, e ClC-6 e -7. ClC-1 e ClC-2 sono canali del cloruro di membrana plasmatica come lo sono ClC-Ka e ClC-Kb (ampiamente espressi nel rene) quando associati a barttin (ENSG00000162399), una proteina 2TM di 320 aminoacidi (Estévez et al., 2001). La localizzazione di CIC-3, ClC-4 e ClC-5 è probabile che sia prevalentemente intracellulare, e rapporti recenti indicano che ClC-4, ClC-5 e ClC-7 (e per inferenza ClC-3 e ClC-6) funzionano come antiporter Cl -/H+, piuttosto che classici canali Cl (Picollo e Pusch, 2005; Scheel et al., 2005; Graves et al., 2008; recensito da Miller, 2006; Pusch et al., 2006). Una posizione intracellulare è stata dimostrata per ClC – 6 e ClC-7 (recensito da Jentsch, 2008). Lo splicing alternativo aumenta la diversità strutturale all’interno della famiglia ClC. È stata descritta la struttura cristallina di due canali CLC batterici (Dutzler et al., 2002). Ogni subunità ClC, con una topologia complessa di segmenti intramembrane 18, contribuisce con un singolo poro a un canale ClC dimerico “a doppia canna” che contiene due pori indipendenti, confermando le previsioni delle precedenti indagini funzionali e strutturali (recensito da Chen, 2005; Pusch et al., 2006; Dutzler, 2007; Jentsch, 2008). Come trovato per ClC-4, ClC-5 e ClC-7, l’omologo procariotico ClC (ClC-ec1) funziona come un antiporter H+/Cl, piuttosto che come un canale ionico (Accardi e Miller, 2004).

I canali ClC visualizzano la sequenza di permeabilità Cl- > Br – > I – (a pH fisiologico); per ClC-3 è stato anche affermato I- > Cl -. ClC-1 ha una significativa probabilità di apertura al potenziale di membrana a riposo, rappresentando il 75% della conduttanza di membrana a riposo nel muscolo scheletrico ed è importante per la stabilizzazione del potenziale di membrana. S-(-) CPP, A-9-C e acido niflumico agiscono intracellularmente e presentano un blocco fortemente voltaggio-dipendente con forte inibizione a tensioni negative e sollievo del blocco a potenziali depolarizzati (Liantonio et al., 2007 e recensito da Pusch et al., 2002). L’inibizione di ClC-2 dal peptide GaTx2, dal veleno di Leiurus quinquestriatus herbareus, è probabile che si verifichi attraverso l’inibizione del gating del canale, piuttosto che il blocco diretto del canale aperto (Thompson et al., 2009). Sebbene ClC-2 possa essere attivato dal gonfiore cellulare, non corrisponde al canale anionico regolato dal volume (VRAC) (vedi sotto). Le potenziali funzioni fisiologiche alternative per ClC-2 sono riviste da Planells-Cases e Jentsch (2009). L’espressione funzionale di CLC-Ka umano e ClC-Kb richiede la presenza di barttin (Estévez et al., 2001; Scholl et al., 2006). L’omologo roditore (ClC-K1) di ClC-Ka dimostra un’espressione limitata come omomero, ma la sua funzione è potenziata da barttin che aumenta sia la probabilità di apertura del canale nell’intervallo fisiologico dei potenziali che la conduttanza del singolo canale (Estévez et al., 2001; Scholl et al., 2006). ClC-Ka è approssimativamente da cinque a sei volte più sensibile al blocco da 3-fenil – CPP e DIDS rispetto a ClC-Kb, mentre i derivati benzofurani di nuova sintesi hanno mostrato la stessa affinità di blocco (<10 µM) su entrambe le isoforme CLC-K (Liantonio et al., 2008). Le proprietà biofisiche e farmacologiche di ClC-3 e la relazione della proteina con il VRAC endogeno (vedi Guan et al., 2006; Alekov e Fahlke, 2008) sono controversi e ulteriormente complicati dalla possibilità che ClC-3 possa funzionare sia come scambiatore Cl-/H+ che come canale ionico (Picollo e Pusch, 2005; Wang et al., 2006; Alekov e Fahlke, 2008). Le proprietà funzionali tabulate sono quelle più coerenti con la stretta relazione strutturale tra ClC-3, ClC-4 e ClC-5. L’attivazione di CLC-3 espresso eterologicamente da gonfiore cellulare in risposta a soluzioni ipotoniche è contestata, così come molti altri aspetti della sua regolazione. CIC-4 può funzionare in due modalità di trasporto: una modalità di slittamento in cui si comporta come un canale ionico e una modalità di scambiatore in cui la velocità di trasporto unitaria è 10 volte inferiore (Alekov e Fahlke, 2009). ClC – 7 si associa a una subunità β, Ostm1, che aumenta la stabilità del primo (Lange et al., 2006).

CFTR: CFTR, un 12TM, proteina di tipo ABC, è un canale Cl della membrana cellulare epiteliale regolato da cAMP coinvolto nel normale trasporto di liquidi attraverso vari epiteli. La mutazione più comune in CFTR (cioè il mutante della delezione, ΔF508) si traduce in un traffico compromesso di CFTR e riduce la sua incorporazione nella membrana plasmatica causando fibrosi cistica. I canali che trasportano la mutazione ΔF508 che fanno traffico alla membrana plasmatica dimostrano difetti di gating. Oltre ad agire come un canale anionico di per sé, CFTR può agire come un regolatore di molti altri conductances tra cui l’inibizione della epiteliali dei canali del Na (ENaC), calcio-attivati canali del cloro (CaCC) e AFDABILE, l’attivazione del esteriormente rettificando canale del cloro (ORCC), e la valorizzazione della sulfonilurea sensibilità renale midollare esterna canale del potassio (ROMK2) (recensito da Nilius e Droogmans, 2003). CFTR regola anche TRPV4, che fornisce il segnale Ca2 + per la diminuzione del volume normativo (RVD) negli epiteli delle vie aeree (Arniges et al., 2004). Le attività di CFTR e degli scambiatori cloruro-bicarbonato SLC26A3 (DRA) e SLC26A6 (PAT1) sono reciprocamente potenziate da un’associazione fisica tra il dominio regolatorio (R) di CFTR e il dominio STAS dei trasportatori SCL26, un effetto facilitato dalla fosforilazione mediata da PKA del dominio R di CFTR (Ko et al., 2004).

Correttore di composti che aiuti il pieghevole di ΔF508CFTR per aumentare la quantità di proteina espressa e potenzialmente consegnato alla superficie delle cellule includono VX-532 (che è anche un potenziatore), Corr-3a e Corr-4a . L’inibizione della CFTR mediante applicazione intracellulare del peptide GaTx1, dal veleno di Leiurus quinquestriatus herbareus, si verifica preferenzialmente per lo stato chiuso del canale (Fuller et al., 2007). CFTR contiene due domini di legame nucleotidico citoplasmatico (NBD) che legano l’ATP. Si ipotizza un singolo ciclo aperto-chiusura per coinvolgere, in sequenza: legame di ATP al N-terminale NBD1, legame ATP al C-terminale NBD2 che porta alla formazione di un dimero intramolecolare NBD1-NBD2 associato allo stato aperto, e successiva idrolisi di ATP a NBD2 facilitando la dissociazione del dimero e la chiusura del canale, e l’inizio di un nuovo ciclo di gating (Aleksandrov et al., 2007; Muallem e Vergani, 2009). La fosforilazione da parte di PKA in siti all’interno di un dominio di regolazione citoplasmatica (R) facilita l’interazione dei due domini NBD. PKC (e PKGII all’interno delle cellule epiteliali intestinali attraverso la formazione cGMP stimolata dalla guanilina) regolano positivamente l’attività CFTR.

Canale del cloruro attivato dal calcio: i canali del cloruro attivati dal calcio intracellulare (CaCC) sono ampiamente espressi in cellule eccitabili e non eccitabili dove svolgono diverse funzioni (Hartzell et al., 2005). La natura molecolare di CaCC non è chiara con entrambi i geni CLCA e i MIGLIORI geni considerati come probabili candidati (Loewen e Forsythe, 2005; Hartzell et al., 2008). È ora accettato che i prodotti di espressione CLCA difficilmente formino canali di per sé e probabilmente funzionino come proteine di adesione cellulare, o siano secreti (Patel et al., 2009). Le bestrofine codificate dai geni hbest1-4 hanno una topologia più coerente con i canali ionici (vedi Hartzell et al., 2008) e formano canali di cloruro che sono attivati da concentrazioni fisiologiche di Ca2+, ma non è noto se tale attivazione sia diretta (Hartzell et al., 2008). Tuttavia, le correnti generate dalla migliore sovraespressione non assomigliano alle correnti CaCC native. Recentemente, è stata identificata una nuova famiglia di geni, TMEM16 (anoctamin-1), che produce correnti Cl attivate da Ca2+con cinetica simile alle correnti CaCC native registrate da diversi tipi di cellule (Caputo et al., 2008; Schroeder et al., 2008; Yang et al., 2008; Pifferi et al., 2009; Rock et al., 2009). Knockout di TMEM16 abolisce CaCC in diversi tessuti epiteliali (Yang et al., 2008)

Blocco di ICl(Ca) da niflumic acid DID e 9-AC voltaggio-dipendenti, mentre il blocco da NPPB è indipendente dalla tensione (Hartzell et al., 2005). Acido niflumico extracellulare, DCDPC e A-9-C(ma non DIDS) esercitano un effetto complesso su ICl (Ca) nella muscolatura liscia vascolare, migliorando e inibendo le correnti dirette verso l’interno e verso l’esterno in modo dipendente da i (vedi Leblanc et al., 2005 per sommario). Esiste anche un notevole crossover in farmacologia con canali K+attivati da Ca2+ a grande conduttanza (vedere Greenwood e Leblanc, 2007 per una panoramica). Due nuovi composti, CaCCinh – A01 e CaCCinh-B01, sono stati recentemente identificati come bloccanti del CaCC nelle cellule epiteliali intestinali umane T84 (vedi De La Fuente et al., 2008 per le strutture). CaMKII modula il CaCC in modo tessuto-dipendente (recensito da Hartzell et al., 2005; Leblanc et al., 2005). Gli inibitori di CaMKII bloccano l’attivazione di ICl (Ca) nelle cellule T84 ma non hanno alcun effetto nelle cellule acinari parotidee. Nelle cellule muscolari lisce tracheali e arteriose, ma non nei miociti della vena porta, l’inibizione di CaMKII riduce l’inattivazione di ICl(Ca). Intracellulare Ins (3,4,5,6) P4 può agire come un regolatore negativo endogeno dei canali CaCC attivati da Ca2+, o CaMKII. I CaCC muscolari lisci sono anche regolati positivamente dalla fosfatasi Ca2 + – dipendente, dalla calcineurina (vedi Leblanc et al., 2005 per sommario).

Maxi chloride channel: I Maxi Cl – canali sono canali ad alta conduttanza, anioni-selettivi, inizialmente caratterizzati nel muscolo scheletrico e successivamente trovati in molti tipi di cellule tra cui neuroni, glia, muscolo cardiaco, linfociti, secernenti e assorbenti epiteli, cellule macula densa del rene e sincitiotrofoblasti della placenta umana (Sabirov e Okada, 2009). Il significato fisiologico del maxi Cl – canale è incerto, ma i ruoli nella regolazione del volume cellulare e nell’apoptosi sono stati rivendicati. L’evidenza suggerisce un ruolo per i canali maxi Cl come via conduttiva nel rilascio indotto dal gonfiore di ATP dalle cellule mammarie C127i del topo che può essere importante per la segnalazione autocrina e paracrina da parte delle purine (Sabirov et al., 2001; Dutta et al., 2002). Un canale simile media il rilascio di ATP dalle cellule della macula densa all’interno dello spesso ascendente del ciclo di Henle in risposta ai cambiamenti nella concentrazione di NaCl luminale (Bell et al., 2003). Una famiglia di canali Cl umani ad alta conduttanza (TTYH1-3) che assomigliano ai Maxi canali Cl è stata clonata (Suzuki e Mizuno, 2004), ma in alternativa, i Maxi canali Cl sono stati anche suggeriti per corrispondere al canale anionico voltaggio – dipendente, VDAC, espresso alla membrana plasmatica (Bahamonde et al., 2003; Okada et al., 2004).

Condizioni ioniche diverse possono contribuire a stime variabili di γ riportate in letteratura. L’inibizione da parte dell’acido arachinonico (e degli acidi grassi cis-insaturi) è indipendente dalla tensione, si verifica in un sito intracellulare e comporta sia l’arresto del canale (Kd= 4-5 µM) che una riduzione di γ (Kd= 13-14 µM). Il blocco dell’attività del canale da parte di SITS, DIDS, Gd3+ e acido arachidonico è parallelo alla diminuzione del rilascio indotto dal gonfiore di ATP (Sabirov et al., 2001); (Dutta et al., 2002). L’attivazione del canale da parte degli antiestrogeni nelle registrazioni di cellule intere richiede la presenza di nucleotidi intracellulari ed è prevenuta dal pretrattamento con 17β-estradiolo, dibutrile cAMP o dialisi intracellulare con GDPßS (Diaz et al., 2001). L’attivazione da parte del tamoxifene è soppressa da basse concentrazioni di acido okadaico, suggerendo che un evento di defosforilazione da parte della fosfatasi proteica PP2A si verifica nella via di attivazione (Diaz et al., 2001). Al contrario, 17β-estradiolo e tamoxifene sembrano inibire direttamente il maxi canale Cl della placenta umana ricostituita in liposomi giganti e registrata in patch asportate (Riquelme, 2009).

Canali di cloruro regolati dal volume: i canali di cloruro attivati dal volume (chiamati anche VSOAC, canale osmolyte/anione organico sensibile al volume; VRC, canale regolato dal volume e VSOR, canale anionico rettificante verso l’esterno sensibile all’espansione del volume) partecipano a RVD in risposta al gonfiore cellulare. VRAC può anche essere importante per molti altri processi tra cui la regolazione dell’eccitabilità della membrana, il trasporto transcellulare di Cl, l’angiogenesi, la proliferazione cellulare, la necrosi, l’apoptosi e il rilascio di glutammato dagli astrociti (recensito da Nilius e Droogmans, 2003; Mulligan e MacVicar, 2006; Okada et al., 2009). VRAC può non essere una singola entità, ma può invece rappresentare un numero di canali diversi che sono espressi in misura variabile in diversi tessuti e sono differenzialmente attivati dal gonfiore cellulare. Oltre ai prodotti di espressione ClC-3 (vedi sopra) diversi ex candidati VRAC tra cui MDR1 P-glycoprotein, Icln, Band 3 anion exchanger e phospholemman non sono più considerati in grado di svolgere questa funzione (vedi recensioni di d’Anglemont de Tassigny et al., 2003; Nilius e Droogmans, 2003; Sardi et al., 2003).

Oltre a condurre anioni monovalenti, in molti tipi di cellule l’attivazione di VRAC da uno stimolo ipotonico può consentire l’efflusso di osmoliti organici come amminoacidi e polioli che possono contribuire alla RVD.

Altri canali del cloruro: oltre ad alcuni canali intracellulari del cloruro che non sono considerati qui, sono stati descritti funzionalmente canali della membrana plasmatica diversi da quelli elencati. Molte cellule e tessuti contengono ORCC che possono corrispondere a VRAC attivo in condizioni isotoniche. Un canale Cl attivato dal campo che non corrisponde a CFTR è stato descritto nelle cellule di Paneth intestinale (Tsumura et al., 1998). Un canale Cl attivato da cGMP con una dipendenza da Ca2 + intracellulare sollevato è stato registrato in vari tipi di cellule muscolari lisce vascolari, che ha una farmacologia molto diversa dal CaCC ‘convenzionale’ (vedi Matchkov et al., 2004; Piper and Large, 2004). È stato anche descritto un canale anionico attivato da protoni, che raddrizza esternamente (Lambert e Oberwinkler, 2005).