Discussione
I vermi adulti C. sinensis che sono stati incubati in mezzi di brodo hanno prodotto più di 4.000 uova/verme/giorno all’inizio. Successivamente, i conteggi di uova sono diminuiti a poco più di 1.000 al giorno 7 e a 300-400 al giorno 14. I conteggi sono diventati inferiori a 100 al giorno 28 nei mezzi di brodo. I conteggi erano simili tra loro tra 3 mezzi di brodo. Contrariamente a ciò, i conteggi nell’anima di Locke erano rispettivamente 220±44 e 1023±64 al giorno 1 e 3. Questi conteggi erano inferiori a quelli nei mezzi di brodo all’inizio, ma i vermi producevano più uova al giorno 21 e più tardi. I vermi nei mezzi del brodo hanno prodotto le loro uova più vigorosamente alla fase iniziale di incubazione mentre quelli nella soluzione del Locke hanno prodotto meno uova giornalmente ma per un periodo più lungo. I conteggi giornalieri di 4.000 uova di un verme adulto erano compatibili con il numero medio stimato di 3.770 uova di un essere umano infetto .
In base al conteggio delle uova, le uova totali prodotte da un verme adulto incubato, che è stato recuperato dai conigli dopo 8 settimane di infezione, sono state stimate in media 37.274±2.988. Questi conteggi totali delle uova erano simili indipendentemente dalla soluzione di coltivazione o dai mezzi. La conta giornaliera delle uova diminuiva rapidamente e l’utero si svuotava durante la coltivazione. Pertanto, gli attuali conteggi giornalieri delle uova rappresentavano che i vermi coltivati in vitro producevano solo le uova intrauterine che erano preformate nel loro utero mentre vivevano nei conigli prima della coltivazione. Sulla base dei dati, si stima che una gravida C. sinensis contenga circa 37.000 uova nel suo utero e produca circa 4.000 uova ogni giorno. Di conseguenza, le uova possono rimanere nell’utero circa 10 giorni per la maturazione intrauterina. La maggior parte delle uova nell’utero sono state trovate mature e il miracidio si è già sviluppato, ma alcune di esse erano immature principalmente nell’utero prossimale. Quelle uova immature non sono riuscite a svilupparsi ulteriormente durante la coltivazione. Questi risultati suggeriscono che i vermi coltivati non sono in grado di formulare nuove uova vitali e la maturazione delle uova immature preformate è anche impossibile dalla coltivazione in vitro.
Le uova di C. sinensis hanno una dimensione di 28-31×13-16 µm, con un opercolo all’estremità conica e una piccola manopola abopercolare . Nel presente studio, le uova espulse hanno mostrato un contorno anormale mentre il verme sopravviveva più a lungo. La lunghezza media dell’uovo è stata ridotta gradualmente e significativamente nella soluzione di Locke (27,49±0,48 µm) e in tutti i mezzi di brodo. La riduzione della lunghezza ha comportato una riduzione del valore FMI. Il FMI è stato proposto come parametro per l’analisi biometrica per approssimare il volume di uova per trematodi eterofidi e opistorchiidi . Nella presente inchiesta, i valori FMI sono diminuiti al giorno 60 nella soluzione di Locke e al giorno 90 nei mezzi di brodo. I valori FMI diminuiti suggeriscono una riduzione del volume dell’uovo mediante restringimento della lunghezza e degenerazione del contenuto. La maggior parte delle uova prodotte dopo 60 giorni di coltivazione in vitro erano deformate e il loro rapporto lunghezza/larghezza era inferiore a 1,7 e il valore FMI era inferiore a 7.000. La maggior parte di queste uova sono state determinate non vitali quando macchiate di blu tripano. La coltivazione per 60 giorni potrebbe essere il periodo massimo di vitalità dell’uovo.
L’osservazione microscopica della luce ha rivelato l’accumulo di vacuoli e masse scure all’interno del guscio d’uovo poiché la coltivazione è durata più di 60 giorni. I vacuoli e le masse scure sembravano essere cellule vitelline deformate come mostrato in O. viverrini . Questi materiali nelle uova suggerivano che le cellule vitelline o altri materiali per la formazione di uova erano degenerate e le uova erano abortive. Le uova mature che formano il miracidio possono sopravvivere a lungo, ma quelle abortite no. La degenerazione dei materiali interni potrebbe aver indotto deformità e riduzione del volume dell’uovo. Uno studio ha trovato uova deformate quando adulti gravidi di Echinostoma caproni maturi conservati nella soluzione di Locke fino a 4 mesi a 4°C. Una possibile spiegazione per i cambiamenti di cui sopra può essere improprio quinone concia che è associato al processo di formazione guscio d’uovo . La coltivazione in vitro a lungo termine può aver influenzato questo processo enzimatico mediato dalla fenolo – ossidasi con conseguente guscio d’uovo deformato . Pertanto una prolungata coltivazione in vitro di C. sinensis può deformare le uova e la loro vitalità.
Le uova mature di C. sinensis contengono una manopola abopercolare molto poco appariscente. O. viverrini, un trematode epatico strettamente correlato, mostra anche una manopola abopercolare molto piccola o leggermente sviluppata delle uova . Nel presente studio, una manopola opercolare del guscio d’uovo è diventata più prominente nella maggior parte delle uova dopo 60 giorni di incubazione. L’aspetto di una manopola abopercolare così prominente era ovvio nella maggior parte delle uova degenerate. Krejci e Fried hanno dimostrato che la manopola abopercular può essere superficiale o profondamente infolded nel guscio d’uovo in caso di Echinostoma caproni e E. trivolvis rispettivamente. Nel presente studio non è stata osservata l’infiltrazione di una manopola abopercolare che circonda il guscio. La manopola abopercular prominente può essere un’estensione della manopola poco appariscente normale esistita in risposta alla fisiologia cambiante dei vermi morenti. Presi insieme, è difficile per i trematodi produrre uova normali vitali mediante coltivazione in vitro.
La struttura superficiale delle uova, osservata da SEM, sembrava essere una caratteristica morfologica adatta per comprendere lo stato del guscio d’uovo. Tra gli opistorchiidi, la superficie dell’uovo di C. sinensis è estremamente scolpita per creare rughe interlacciate di varia altezza che aiutano la capacità di accumulare fibre acquatiche naturali e ad aumentare la possibilità di contatto con gli ospiti di molluschi , . Nel presente studio, la ruga superficiale diminuita è stata osservata dal SEM delle uova abortite. Questo grinza diminuita con la manopola abopercular prominente può essere un risultato del processo degenerante del guscio d’uovo.
Il presente studio presentava alcune limitazioni. Non c’erano dati diretti sulla vitalità dell’uovo da confrontare con i cambiamenti morfologici. La schiusa in vitro delle uova può fornire informazioni accurate sulla vitalità dell’uovo, ma quella delle uova di C. sinensis non è ancora in grado. Anche i dati di morfologia e fisiologia dei vermi incubati erano limitati.
In conclusione, il C coltivato. i vermi sinensis nei mezzi di brodo passano uova vitali per 60 giorni che vengono preformate nel loro utero durante la loro sopravvivenza nei conigli. Le uova immature preformate non sono in grado di sviluppare miracidium mediante coltivazione in vitro. Un adulto maturo di C. sinensis contiene circa 37.000 uova nell’utero e produce circa 4.000 uova al giorno. Le uova deformate del valore FMI inferiore a 7.000 e il rapporto lunghezza / larghezza inferiore a 1,7 non sono vitali.