Finora nella nostra serie Plasmids 101 abbiamo lavorato attraverso la mappa plasmidica: resistenza agli antibiotici, origine della replicazione e così via. Fino a questo punto possiamo replicare il nostro plasmide e assicurarci che le cellule lo mantengano; il passo successivo è ottenere il plasmide per esprimere il nostro gene di interesse. Inserire il promotore – l’elemento responsabile per l’avvio della trascrizione del vostro inserto in RNA.
In pratica, il termine” promotore ” descrive la combinazione del promotore (sito di legame della RNA polimerasi) e degli operatori (elementi di risposta). I promotori sono lunghi da 100 a 1000 coppie di basi e si trovano a monte dei loro geni bersaglio. La sequenza della regione del promotore controlla il legame della RNA polimerasi e dei fattori di trascrizione, pertanto i promotori svolgono un ruolo importante nel determinare dove e quando verrà espresso il gene di interesse.
L’RNA polimerasi(s)
RNA è trascritto dal DNA utilizzando una RNA polimerasi (RNAP). Nei batteri questo è fatto da un singolo enzima; tuttavia, eucarioti hanno polimerasi muliple che sono ciascuno responsabile di un sottoinsieme specifico di RNA. Per ottenere questa specificità, l’RNAP eucariotico può riconoscere e legarsi a specifici elementi del promotore. Ciò significa che il promotore presente nella spina dorsale del plasmide deve essere compatibile con il tipo di RNA che deve essere prodotto: se si desidera l’mRNA (per l’espressione genica) è necessario utilizzare un promotore RNAP II, mentre i piccoli RNA (come shRNA) sono trascritti dai promotori RNAP III. Questo post presenta promotori per la trascrizione generale RNAP II e RNAP III; tuttavia, l’uso di LTR virali come promotori RNAP II è comunemente impiegato in costrutti lentivirali e retrovirali e ne discuteremo in un futuro post su parti di vettori virali.
Specificità del promotore
Oltre a scegliere un promotore basato sul tipo di trascrizione dell’RNA, dovrai anche assicurarti che il tuo plasmide abbia un promotore adatto a lavorare nel tuo organismo ospite. Poiché i meccanismi di trascrizione differiscono tra tipi di cellule o organismi, i promotori devono essere ugualmente variabili. I promotori batterici funzionano soltanto in cellule procariotiche e tipicamente soltanto nella stessa o specie strettamente imparentata da cui sono stati derivati. Allo stesso modo, i vari tipi di cellule eucariotiche (mammiferi, lieviti, piante, ecc.) richiedono promotori unici e c’è pochissimo crossover. In generale, i promotori nei batteri sono meno diversi e complessi, avendo meno parti di quelle nelle cellule eucariotiche. Alcuni promotori sono costitutivamente attivi e su tutto il tempo, mentre altri sono più attentamente controllati. I promotori regolamentati potrebbero agire solo in determinati tessuti o in determinati momenti dello sviluppo o ci possono essere modi per accenderli o spegnerli a volontà con una sostanza chimica, calore o luce. Nella cellula, i promotori stessi sono controllati da altri fattori regolatori: potenziatori, elementi di confine, isolanti e silenziatori; tuttavia, può verificarsi una certa “perdita” di trascrizione. Questo non è normalmente un grosso problema per le cellule, ma può confondere i risultati della ricerca o addirittura uccidere le cellule se il gene di interesse è tossico. Per combattere questo, gli scienziati hanno creato promotori sintetici, che in genere includono una combinazione di altri elementi promotori, e tendono ad essere più strettamente regolamentati.
Promotori comuni per eucarioti e procarioti
Abbiamo incluso due tabelle di riferimento che elencano di seguito alcuni dei più comuni promotori batterici e mammiferi. Queste liste non è affatto esaustivo, ma dovrebbe essere un buon punto di partenza quando si cerca di scegliere il promotore perfetto!
Promotori Eucariotici
| Promotore | utilizzato Principalmente per | trascrizione di RNA | Descrizione | Espressione | Ulteriori considerazioni |
| CMV | Generale l’espressione | mRNA | Forte dei mammiferi espressione promotore del citomegalovirus umano | Costitutivo | Può contenere un potenziatore della regione. Può essere silenziato in alcuni tipi di celle. |
| EF1a | Espressione generale | mRNA | Forte espressione dei mammiferi dal fattore di allungamento umano 1 alfa | Costitutivo | Tende a dare un’espressione coerente indipendentemente dal tipo di cellula o dalla fisiologia. |
| SV40 | Espressione generale | mRNA | Promotore di espressione dei mammiferi dal virus vacuolante simiano 40 | Costitutivo | Può includere un potenziatore. |
| PGK1 (umano o topo) | Espressione generale | mRNA | Promotore di mammiferi dal gene della fosfoglicerato chinasi. | Costitutivo | Espressione diffusa, ma può variare in base al tipo di cella. Tende a resistere alla regolazione del promotore a causa della metilazione o della deacetilazione. |
| Ubc | Espressione generale | mRNA | Promotore dei mammiferi dal gene dell’ubiquitina C umana | Costitutivo | Come suggerisce il nome, questo promotore è onnipresente. |
| beta actina umana | Espressione generale | mRNA | Promotore mammifero del gene beta actina | Costitutivo | Onnipresente. La versione di pollo è comunemente usata negli ibridi del promotore. |
| CAG | Espressione generale | mRNA | Forte promotore ibrido dei mammiferi | Costitutivo | Contiene CMV enhancer, pollo beta actina promotore, e coniglio beta-globina splice accettore. |
| TRE | Espressione generale | mRNA | Promotore dell’elemento di risposta della tetraciclina | Inducibile con tetracilina o suoi derivati. | Contiene tipicamente un promotore minimo con bassa attività basale e diversi operatori di tetraciclina. La trascrizione può essere attivata o disattivata a seconda di quale tet transactivator viene utilizzato. |
| UAS | Espressione generale | mRNA | Promotore di Drosophila che contiene siti di legame Gal4 | Specifico | Richiede la presenza del gene Gal4 per attivare il promotore. |
| Ac5 | Espressione generale | mRNA | Forte promotore di insetti del gene Drosophila Actina 5c | Costitutivo | Comunemente usato nei sistemi di espressione per la Drosophila. |
| Poliedrina | Espressione generale | mRNA | Forte promotore di insetti da baculovirus | Costitutivo | Comunemente usato nei sistemi di espressione per cellule di insetti. |
| CaMKIIa | Espressione genica per optogenetica | mRNA | Ca2+/calmodulina-dipendente protein chinasi II promotore | Specifico | Utilizzato per l’espressione neuronale/CNS. Modulato da calcio e calmodulina. |
| GAL1, 10 | Espressione generale | mRNA | Lievito promotori adiacenti, trascritti in modo divergente | Inducibili con galattosio; repressibili con glucosio | Possono essere utilizzati indipendentemente o insieme. Regolato da GAL4 e GAL 80. |
| TEF1 | Espressione generale | mRNA | Promotore del fattore di allungamento della trascrizione del lievito | Costitutivo | Analogo al promotore EF1A dei mammiferi. |
| GDS | Espressione generale | mRNA | Forte promotore di espressione del lievito da gliceraldeide 3-fosfagedeidrogenasi | Costitutivo | Molto forte, chiamato anche TDH3 o GAPDH. |
| ADH1 | Espressione generale | mRNA | Promotore di lievito per alcool deidrogenasi I | Represso da etanolo | Versione integrale è forte con alta espressione. I promotori troncati sono costitutivi con espressione inferiore. |
| CaMV35S | Espressione generale | mRNA | Forte promotore vegetale del Virus del Mosaico del Cavolfiore | Costitutivo | Attivo nei dicotiledoni, meno attivo nelle monocotiledoni, con una certa attività nelle cellule animali. |
| Ubi | Espressione generale | mRNA | Promotore vegetale dal gene dell’ubiquitina di mais | Costitutivo | Dà un’alta espressione nelle piante. |
| H1 | espressione di RNA piccolo | shRNA | Dal promotore di RNA polimerasi III umano | Costitutivo | Può avere un’espressione leggermente inferiore rispetto a U6. Può avere una migliore espressione nelle cellule neuronali. |
| U6 | piccola espressione di RNA | shRNA | Dal piccolo promotore nucleare U6 umano | Costitutivo | Viene utilizzato anche U6 murino, ma potrebbe essere meno efficiente. |
Procariote promotori
| Promotore | utilizzato Principalmente per | Descrizione | Espressione | Ulteriori considerazioni |
| T7 | trascrizione in vitro/ in generale l’espressione | Promotore dal batteriofago T7 | Costitutiva, ma richiede la T7 RNA polimerasi. | Quando viene utilizzato per la trascrizione in vitro, il promotore guida la trascrizione sense O antisense a seconda del suo orientamento al gene. |
| T7lac | Alti livelli di espressione genica | Promotore da batteriofago T7 più operatori lac | Espressione basale trascurabile quando non indotta. Richiede T7 RNA polimerasi, che è anche controllato dall’operatore lac. Può essere indotto da IPTG. | Si trovano comunemente nei vettori pET. Molto strettamente regolata dagli operatori lac. Buono per modulare l’espressione genica attraverso varie concentrazioni di induttori. |
| Sp6 | trascrizione in vitro/ espressione generale | Promotore da batteriofago Sp6 | Costitutivo, ma richiede SP6 RNA polimerasi. | La polimerasi SP6 ha un’alta processività. Quando viene utilizzato per la trascrizione in vitro, il promotore guida il senso o la trascrizione antisenso a seconda del suo orientamento al gene. |
| araBAD | Espressione generale | Promotore dell’operone metabolico dell’arabinosio | Inducibile dalla repressione dell’arabinosio e del catabolito represso in presenza di glucosio o dal legame competitivo del fucosio antiinduttore | Più debole. Si trovano comunemente nei vettori pBAD. Buono per una rapida regolazione e bassa espressione basale; tuttavia, non adatto per modulare l’espressione genica attraverso varie concentrazioni di induttori. |
| trp | Alti livelli di espressione genica | Promotore da E. coli triptofano operon | Repressible | Viene spento con alti livelli di triptofano cellulare. |
| lac | Espressione generale | Promotore dell’operone lac | Costitutivo nell’assenso del repressore lac (lacI o lacIq). Può essere indotto da IPTG o lattosio. | Promotore che perde con un’espressione un po ‘ debole. La mutazione di lacIq aumenta l’espressione del repressore 10x, stringendo così la regolazione del promotore lac. Buono per modulare l’espressione genica attraverso varie concentrazioni di induttori. |
| Ptac | Espressione generale | Promotore ibrido di lac e trp | Regolato come il promotore lac | Contiene -35 regione da trpB e -10 regione da lac. Regolazione molto stretta. Buono per modulare l’espressione genica attraverso varie concentrazioni di induttori. Generalmente migliore espressione di lac da solo. |
| pL | Alti livelli di espressione genica | Promotore da batteriofago lambda | Può essere temperatura regulatable | Spesso accoppiato con la temperatura sensibile ci857 repressore. |
| T3 | trascrizione in vitro/in generale l’espressione | Promotore di T3 batteriofago | Costitutiva, ma richiede T3 RNA polimerasi | Quando utilizzato per la trascrizione in vitro, il promotore spinge il senso O antisenso trascrizione a seconda del suo orientamento per il gene |
Anche se questo elenco è un ottimo posto per iniziare, le tabelle di cui sopra non approfondire il tessuto o di sviluppo specifici promotori a disposizione degli scienziati. I plasmidi sono spesso utilizzati per scopi terapeutici, e in questi casi è importante identificare i giusti promotori specifici del tessuto come descritto dai ricercatori del NIH qui.
Nota: A. Max Juchheim ha contribuito alla stesura di questo articolo.