Misurazione comparativa di CNP e NT-proCNP in campioni di sangue umano:una valutazione metodologica

Introduzione

Peptide natriuretico di tipo C (CNP), identificato nel 1990 da Sudoh et al., è il membro più antico della famiglia del peptide natriuretico . CNP stimola selettivamente il recettore natriuretico umano del peptide 2 (NPR2), che attiva la chinasi cGMP-dipendente (cGK) elevando la concentrazione intracellulare di cGMP . Inoltre, CNP lega NPR3 e, a sua volta, disattiva la proteina chinasi A mediante inibizione dipendente dalla proteina Gi dell’adenilato ciclasi . Il CNP ha proprietà anti-proliferative e anti-migratorie ed è stato anche identificato come un fattore rilassante derivato dall’endotelio . Inoltre, la CNP inibisce la restenosi neointimale, riduce il rimodellamento costrittivo vascolare e la lesione da ischemia-riperfusione cardiaca . La CNP svolge un ruolo importante nella crescita ossea, nella riproduzione, nella crescita nervosa, nella re-endotelializzazione, nonché nella funzione renale, pancreatica e cardiaca . Inoltre, il CNP è stato recentemente riconosciuto come coinvolto nello sviluppo della formazione della placca aterosclerotica .

Dovuto la pletora delle funzioni di CNP, questo peptide ha raggiunto l’interesse aumentante nella ricerca cardiovascolare durante gli anni scorsi. Tuttavia, gli studi riguardanti le concentrazioni di CNP nei campioni di sangue sono incoerenti. Alcuni di questi studi hanno misurato le concentrazioni di CNP o del suo pro-peptide amino-terminale (NT-proCNP) in campioni di siero e altri hanno utilizzato campioni di plasma . Sfortunatamente, i dettagli sui potenziali ritardi durante il prelievo di sangue e la successiva elaborazione del campione non sono ancora stati riportati. Nella letteratura disponibile finora, non esistono dati sulla differenza delle concentrazioni di CNP/NT-proCNP tra campioni sierici e plasmatici. Inoltre, l’influenza del ritardo nell’elaborazione del campione di sangue rimane poco chiara. Inoltre, la concentrazione di CNP nei campioni sierici e plasmatici variava notevolmente (Tabella 1). Pertanto, lo scopo di questo studio era di rispondere alle seguenti domande metodologiche: (1) Il trattamento ritardato dei campioni di sangue conservati a temperatura ambiente causa pregiudizi? (2) C’è qualche differenza tra le concentrazioni sieriche e plasmatiche di CNP o NT-proCNP? (3)Queste differenze dipendono dal tempo?

Metodi

Abbiamo studiato 12 volontari maschi (età media 29 ± 2 anni, peso normale, nessuna terapia farmacologica, nessuna storia di malattie cardiovascolari o di altro tipo, 3 fumatori). Da tutti i soggetti indagati è stato ottenuto il consenso informato. Triplette di campioni di sangue a digiuno sono state prelevate da tutti i volontari alle 8 del mattino. I campioni di sangue sono stati raccolti utilizzando il sistema di raccolta S-Monovette® da 7,5 ml (Sarstedt, Nümbrecht, Germania) contenente attivatore della coagulazione (caolino) per i campioni di siero, sodio-citrato per i campioni di plasma o Potassio–EDTA per i campioni di sangue completi. Tutti i campioni per le analisi basali sono stati immediatamente centrifugati a 2.000 × g per 10 min a 4°C e il surnatante è stato conservato a -70°C fino all’analisi. Per le analisi a medio termine (30 minuti o 2 ore), i campioni di plasma sono stati centrifugati a 2.000 × g per 10 min a temperatura ambiente. Il surnatante è stato rimosso e conservato a temperatura ambiente per 30 minuti o 2 ore. Dopo la coagulazione del sangue, i campioni di siero sono stati trattati in modo identico ai campioni di plasma. Il surnatante è stato salvato e conservato a temperatura ambiente per 30 min o 2 ore. Campioni di sangue completi sono stati conservati a temperatura ambiente senza centrifugazione. Dopo 30 min o 2 ore, i campioni di sangue completi sono stati centrifugati a 2.000 × g per 10 min a 4°C. Il surnatante è stato rimosso e conservato a -70°C fino all’analisi. La concentrazione di CNP è stata misurata utilizzando il kit CNP-22 EIA (#EK-012-03, Phoenix Pharmaceuticals, Karlsruhe, Germania) secondo il protocollo del produttore. La concentrazione di NT-proCNP è stata misurata utilizzando il kit NT-proCNP EIA (Biomedica, Vienna, Austria) secondo il protocollo del produttore. ANOVA unidirezionale è stata utilizzata per il confronto tra gruppi. Per i confronti a coppie, è stato applicato il t-test. I dati sono mostrati come media ± deviazione standard ( SD) o intervallo di confidenza del 95% (95%-CI). La significatività statistica è stata assunta a p < 0,05. I dati sono stati analizzati utilizzando MedCalc® per Windows, Versione 10.0.1.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgio).

Risultati

Come mostrato nella Figura 1a, le concentrazioni basali di CNP nel siero, nel plasma e nei campioni ematici completi erano rispettivamente di 0,997 ± 0,379 ng/ml, 1,933 ± 0,699 ng/ml e 0,991 ± 0,489 ng/ml. Le concentrazioni plasmatiche di CNP erano significativamente più elevate rispetto ai campioni di sangue sierico e completo in tutti i tempi (ANOVA, p = 0,001 al basale, p < 0,001 a 30 ‘ min. e p = 0,003 a 120 ‘ min.). Non è stata osservata alcuna differenza significativa tra il siero e i campioni di sangue completi in qualsiasi momento (ANOVA, p > 0,05). Le concentrazioni basali di NT-proCNP nei campioni sierici, plasmatici e ematici completi sono state rispettivamente di 58,5 ± 28,3 pg / ml, 60,3 ± 23,9 pg/ml e 50,7 ± 21,4 pg/ml (Figura 1b). Nessuna differenza significativa è stata trovata tra i gruppi in qualsiasi momento (ANOVA, p > 0.05). Nei campioni ematici completi, la concentrazione di lattato è aumentata significativamente dopo 2 ore rispetto al valore basale (3,2 ± 0,8 mM vs. 2,0 ± 0,6 mM, p < 0,001). Inoltre, il valore pH è diminuito da 7,34 ± 0.03 al basale a 7,29 ± 0,03 dopo 2 ore (p < 0,001).

Discussione

Il nostro studio ha rivelato che CNP e NT-proCNP sono stabili nel siero e in campioni di sangue completi per almeno due ore a temperatura ambiente. Di conseguenza, la stabilità del peptide CNP molto probabilmente non è influenzata da alcun ritardo nell’elaborazione del campione per almeno due ore. È già stato segnalato che ProCNP (protocollo del produttore, condizioni di conservazione sconosciute dei campioni di sangue) è stabile per almeno 2,5 ore. Di conseguenza, i nostri esperimenti hanno confermato la stabilità di NT-proCNP anche a temperatura ambiente. La concentrazione di NT-proCNP in tutti i tipi di campione è rimasta costante nel corso del tempo fino a 2 ore, indicando una stabilità di lunga durata di questa proteina. Come indicato nella Tabella 1, la concentrazione media di NT-proCNP (56,5 ± 24.3 pg/ml) misurata in questo studio era entro l ‘ intervallo riportato (vedere Tabella 1) di individui sani (3,7-432 pg/ml).

In contrasto con NT-proCNP, la concentrazione di CNP era significativamente più alta nei campioni plasmatici rispetto ai campioni di siero e sangue intero (Figura 1). Finora, né il nostro gruppo né il servizio tecnico dei produttori hanno trovato alcuna prova riguardante l’influenza del tipo di campione sul test ELISA utilizzato in questo studio. Tuttavia, al basale, il surnatante del plasma e i campioni di sangue completi erano identici, ad eccezione del tipo di inibitore della coagulazione del sangue utilizzato. Questo inibitore era citrato di sodio nel gruppo plasmatico e EDTA nel gruppo ematico completo. I campioni di sangue completi hanno rivelato risultati comparabili ai campioni di siero (p = 0,98). Pertanto, è molto probabile che il citrato di sodio possa influenzare significativamente la concentrazione misurata di CNP nel plasma e di conseguenza falsificare i risultati ottenuti con questa tecnica.

Inaspettatamente, le concentrazioni basali di CNP nei campioni plasmatici e sierici erano circa mille volte superiori rispetto ad altre segnalazioni (Tabella 1) . In tutti questi studi è stato utilizzato il saggio radioimmunologico (RIA-Kit) per la determinazione delle concentrazioni di CNP. Al contrario, in altri due studi le concentrazioni di CNP misurate nei campioni sierici e plasmatici erano paragonabili ai nostri risultati per quanto riguarda l’entità della dimensione . È interessante notare che, in questi ultimi studi, è stato utilizzato lo stesso kit ELISA come nella nostra indagine. Anche dopo un’ampia valutazione di vari fattori interni ed esterni, non è stata trovata alcuna spiegazione soddisfatta di questa discrepanza. Le misurazioni di controllo con CNP esogeno nel siero umano hanno rivelato un errore di misurazione non significativo di +7,8% (95% –KI: -). Il peptide CNP utilizzato per la curva di riferimento è stato sintetizzato dal produttore stesso (Phoenix). Al contrario, il peptide CNP utilizzato come controllo “esogeno” è stato fornito da Bachem. Come assicurato da entrambi i produttori, le sequenze di amminoacidi erano identiche e si formavano legami disolfuro in entrambi i peptidi.

Tuttavia, i risultati delle misurazioni del controllo interno possono essere riassunti come segue: Innanzitutto, le misurazioni di controllo eseguite nel nostro studio hanno rivelato che i kit ELISA sono stati utilizzati correttamente, in conformità con le istruzioni del produttore. In secondo luogo, le misurazioni utilizzando campioni di controllo hanno confermato l’idoneità della curva standard applicata. In terzo luogo, i campioni di siero di controllo contenenti CNP esogeno hanno rivelato un’accuratezza accettabile e i risultati sono stati entro l’ordine di grandezza previsto. In quarto luogo, una maggiore concentrazione di CNP nei campioni di plasma è molto probabilmente un manufatto causato dal citrato di sodio.

Come riportato da Clerico e collaboratori, sono note anche differenze relativamente grandi nei risultati tra i diversi metodi RIA e EIA, ad esempio ANP e BNP . Clerico e colleghi hanno concluso che le grandi differenze in questi risultati sono molto probabilmente dovute alla specificità degli anticorpi monoclonali o policlonali utilizzati, alla progettazione del sistema di immunodosaggio (saggio competitivo rispetto a quello non competitivo), alla matrice analitica (siero vs EDTA vs plasma eparinizzato) utilizzata e alla pletora di forme circolanti di peptidi natriuretici, come precedentemente riportato per i saggi immunologici ANP e BNP . Queste fonti metodologiche di bias possono anche essere concepibili per i saggi CNP e NT-proCNP e quindi spiegare la grande differenza nei risultati negli studi citati (Tabella 1).

Limitazioni dello studio

Riconosciamo che una dimensione del campione di 12 è troppo piccola per concludere che non vi è alcuna differenza. Tuttavia, da un punto di vista statistico, sarebbe importante specificare quanto grande deve essere la differenza per essere di rilevanza medica. A nostra conoscenza, quest’ultimo non è ancora chiaramente definito. Pertanto, i mezzi e gli intervalli di confidenza del 95% di tutte le misure sono stati indicati nella figura per consentire a ogni lettore di trarre la propria interpretazione anche dai dati.

In riferimento alle concentrazioni sieriche e plasmatiche, si deve ricordare che i valori riportati nella Tabella 1 sono stati misurati con metodi diversi (RIA, ELISA) in pazienti affetti da diverse patologie. Sarebbe stato molto utile confrontare CNP-RIA con i test CNP-ELISA direttamente utilizzando gli stessi campioni, perché una differenza mille volte nell’ordine di grandezza rimane evidente. Sfortunatamente, le misurazioni dei saggi RIA non erano disponibili nel nostro laboratorio. Per la concentrazione di NT-proCNP, quest’ultimo confronto è stato studiato da Olney e colleghi, dimostrando che il ELISA commerciale (Biomedica Medizinprodukte GmbH & Co KG, Vienna, Austria) ha dato valori che erano in media del 21% (intervallo 11-52%) dei valori RIA. La convalida incrociata dello standard di riferimento del kit ELISA utilizzando il test RIA ha mostrato un disaccordo del 15%.

Sommario

Le misurazioni di CNP e NT-proCNP non sono state probabilmente influenzate dal ritardo della processione del campione o dal tipo di campione di sangue (ad eccezione della CNP nei campioni di plasma). Per i campioni di plasma, solo i campioni di sangue anticoagulato EDTA erano adatti per il test ELISA CNP utilizzato in questo studio. Di conseguenza, la concentrazione di CNP e NT-proCNP potrebbe essere utilizzata in applicazioni cliniche per determinare gli effetti della CNP. Dovrebbe anche essere considerato che la concentrazione di NT-proCNP, essendo solo un sottoprodotto del peptide attivo, può nascondere la vera natura di CNP. Tuttavia, la discrepanza nelle concentrazioni di CNP misurate determinate dai saggi RIA o ELISA rimane ancora inspiegabile, ma sembra probabilmente dovuta a problemi metodologici. Pertanto, come raccomandato per ANP e BNP, anche i saggi immunologici per CNP devono essere standardizzati o armonizzati in futuro.