Microdelezione del cromosoma Y in un padre e nei suoi quattro figli infertili

Abstract

Le microdelezioni di Yq sono associate ad azoospermia e oligozoospermia grave. In generale, gli uomini con delezioni sono sterili e quindi le delezioni non vengono trasmesse ai figli a meno che non vengano eseguite la fecondazione in vitro (IVF) e l’iniezione intracitoplasmatica di sperma (ICSI). Segnaliamo una famiglia insolita caratterizzata da più membri con infertilità e microdelezione Yq. L’anamnesi riproduttiva completa, le analisi dello sperma e i campioni di sangue sono stati raccolti da membri della famiglia pertinenti. La preparazione e la quantificazione del DNA sono state eseguite utilizzando kit commerciali. Per lo screening sono state utilizzate un totale di 27 coppie di set di primer basati su siti con tag di sequenza specifici per la regione di microdelezione Y loci. Southern blots utilizzando CDNA cancellati in azoospermia (DAZ) e ribosomal binding motif (RBM) sono stati quindi analizzati per la conferma. Il probando, i suoi tre fratelli e il padre sono stati tutti trovati per essere cancellati per DAZ ma non RBM. Al momento dell’analisi, il padre del probando era azoospermico mentre i suoi quattro figli erano gravemente oligozoospermici o azoospermici. A differenza del loro padre, i quattro figli sono sterili e non hanno prole, tranne uno di loro che ha raggiunto una figlia solo dopo il trattamento IVF/ICSI per l’infertilità. Le microdelezioni di Yq che coinvolgono il gene DAZ sono associate a un’espressione fenotipica variabile che può includere una fertilità evidentemente normale.

Introduzione

L’infertilità si verifica in ~14% delle coppie (Mosher, 1985) e si stima che le anomalie nel partner maschile siano presenti fino alla metà dei casi (Swerdloff et al., 1985). Gli sforzi per valutare le cause di azoospermia hanno dimostrato che dopo l’esclusione di cause tradizionalmente riconoscibili (cioè cariotipo anormale, ostruzione, varicocoele, difetto ormonale, ecc.), la maggior parte dei casi (50-75%) sono inspiegabili e sono definiti idiopatici (Pryor et al., 1997). Recentemente, è stato riportato che fino al 30% degli uomini con azoospermia ‘idiopatica’ hanno microdelezioni del cromosoma Y (Henegariu et al., 1993; Ma et al., 1993; Nagafuchi et al., 1993; Kobayashi et al., 1994; Najmabadi et al., 1996; Reijo et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Esattamente come e se queste microdelezioni causano azoo / oligozoospermia è oggetto di intense indagini e dibattiti.

Essenziale per l’argomento che Y microdelezioni causano infertilità è l’osservazione che gli uomini fertili raramente manifestano Y microdelezioni. Sono state riportate microdelezioni in quattro uomini fertili su 200 studiati (Pryor et al., 1997). Tuttavia, le eliminazioni in questi uomini erano molto piccole e molto probabilmente rappresentavano un polimorfismo insignificante. Non sono state riportate cancellazioni relativamente grandi del tipo associato all’infertilità maschile in uomini con fertilità normale. Anche se si presume generalmente che queste eliminazioni sorgano de novo e che non ci si aspetterebbe la trasmissione da padre a figlio della microdelezione Y, sono stati riportati alcuni rari casi di trasmissione da padre a figlio della microdelezione del cromosoma Y (Kobayashi et al., 1994; Stuppia et al., 1996; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Tuttavia, la trasmissione verticale di una microdelezione che coinvolge l’eliminato in azoospermia (DAZ) locus dal padre a un figlio è stata riportata in soli tre casi (Kobayashi et al., 1994; Vogt et al., 1996; Pryor et al., 1997). Descriviamo ora una famiglia di quattro generazioni in cui un padre azoospermico e i suoi quattro figli infertili condividono una microdelezione apparentemente identica che include il locus DAZ. Questa famiglia rappresenta il primo e unico rapporto di trasmissione verticale spontanea della delezione di DAZ alla prole multipla. Fornisce la prova che una singola microdelezione di Yq può provocare l’espressione fenotipica variabile negli individui differenti. È clinicamente significativo, in quanto la presenza di una microdelezione non è un marker assoluto per l’infertilità e può essere associata a una fertilità apparentemente normale.

Materiali e metodi

Lo screening per la microdelezione Yq è stato eseguito su base di routine per l’infertilità maschile utilizzando un protocollo esaminato e approvato dall’Institutional Review Board of College of Physicians & Surgeons, Columbia University. I campioni sono stati prelevati dai pazienti dopo il consenso informato.

Analisi dello sperma

I risultati sono stati analizzati utilizzando i criteri OMS con un microscopio a contrasto di fase Nikon.

Le concentrazioni di ormoni nel siero

L’ormone follicolo stimolante (FSH), l’ormone luteinizzante (LH) e il testosterone sono stati misurati mediante analisi immunometrica enzimatica chemiluminescente in fase solida a due siti (Immulite; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA). Gli intervalli normali per gli uomini sono FSH < 10 mIU / ml; LH < 10 mIU/ml; e testosterone 270-1070 ng/dl.

DNA genomico

L’estrazione del DNA genomico dal sangue intero è stata eseguita mediante lisi dei globuli rossi, seguita dalla lisi dei globuli bianchi e dei loro nuclei. Le proteine cellulari sono state rimosse per precipitazione salina e il DNA genomico è stato precipitato con isopropanolo utilizzando Puregene DNA extraction kit (Gentra Systems, Inc. Minneapolis, MN, USA; numero di catalogo. D-5004).

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

I primer sono stati prodotti come oligonucleotidi essiccati su un sintetizzatore automatizzato di DNA (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, Stati Uniti d’America). Un totale di 27 siti con tag di sequenza specifica del cromosoma Y (STS) (Figura 1) sono stati selezionati da una mappa STS (Vollrath et al., 1992). Essi comprendono i tre proposti spermatogenesi loci AZFa, AZFb, e AZFc (secondo Vogt et al., 1996) che coprono intervalli Yq 5, 6 e 7. Come protocollo di screening rapido, un sistema multiplex PCR composto da due a sei diverse coppie di primer è stato utilizzato in un totale di sei reazioni multiplex (Tabella I). Con ogni esecuzione di PCR, sono stati inclusi un controllo femmina e un controllo maschio normale. Tutte le reazioni di PCR sono state eseguite in lastre di policarbonato (Techne®) in una macchina MJ Research®. Le condizioni di PCR erano essenzialmente come precedentemente descritto (Henegariu et al., 1993). Brevemente, in un 14 µl volume totale di reazione, 50 ng di DNA genomico è stato utilizzato come modello, 1 µl di primer soluzione standard (mix di I o II o III o IV o V o VI, che consiste di 10 pmol per primer), 12 µl di `PCR freddo mix’ (1.5 mmol/l MgCl2, 0,2 mmol/l di ciascun dNTP, 5% DMSO, 1× Taq polimerasi reazione buffer senza Mg2+), 1.25 UI di Taq DNA polimerasi (Promega) e 1 goccia di olio. Le miscele complete sono state collocate direttamente in un termociclatore preriscaldato a 94°C. Le condizioni di ciclo per 27 cicli erano: 94°C, 30 s (fusione); 55°C, 45 s (ricottura); e 72°C, 60 s (estensione). Il tempo di estensione finale è stato di 5 min. I prodotti di reazione della PCR sono stati poi separati su gel di agarosio al 3% (Bio-Rad, grado ultra-puro) mediante elettroforesi in tampone TBE. I prodotti PCR sono stati colorati con bromuro di etidio e visualizzati dall’esposizione alla luce ultravioletta. Gli STS che non hanno mostrato amplificazione nelle reazioni multiplex sono stati confermati mediante PCR a reazione singola con appropriati controlli positivi e negativi. Un STS è stato considerato assente dopo tre guasti di amplificazione.

Ibridazione meridionale

Il Southern blotting è stato eseguito secondo il protocollo stabilito (Sambrook et al., 1989). In breve, il DNA genomico 5 µg è stato digerito con HindIII o TaqI, eseguito su un gel di agarosio allo 0,7% in tampone TBE standard, trasferito su una membrana di nylon e ibridato con sonde etichettate con 32P. La sonda DAZ era l’inserto purificato di un plasmide (pDP1577) contenente il cDNA a tutta lunghezza (Reijo et al., 1995). Allo stesso modo, la sonda RBM era l’inserto plasmidico di un clone RBM cDNA (MK5) (Ma et al., 1993).

Determinazione della paternità

La paternità di tutti e quattro i figli è stata confermata mostrando la prevista segregazione di quattro marcatori autosomici altamente polimorfici (Weber e maggio, 1989). Questi erano D21S156, D21S270, D13S132 e D13S159 con eterozigosi rispettivamente di 0,83, 0,86, 0,84 e 0,90.

Ibridazione fluorescente in situ (FISH)

FISH per DAZ è stata eseguita con Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996), utilizzando metodi stabiliti (Yu et al., 1996).

Risultati

Il probando (individuo III 8 in Figura 2) e il suo coniuge (III-9) presentato alla clinica riproduttiva-Endocrinologia-Infertilità presso il Columbia-Presbyterian Medical Center con denuncia di infertilità primaria per 3 anni. I test hanno rivelato un cariotipo normale e livelli normali di ormoni sierici, mentre le analisi dello sperma hanno mostrato una grave oligozoospermia (Tabella II). Lo screening della microdelezione mediante PCR basato su STS ha rivelato la presenza di una microdelezione nel sottointervallo 6D–6F del braccio lungo del cromosoma Y (Figura 1). Durante la discussione, il probando riferì che i suoi due fratelli maggiori (III-4 e III-6) erano noti per essere azoospermici e sterili. Il successivo lavoro ha rivelato che tutti e tre i fratelli avevano una microdelezione apparentemente identica. La biopsia testicolare eseguita su uno di essi (III-6) ha dimostrato la sindrome “solo cellule di Sertoli”.

La scoperta della microdelezione in tre fratelli infertili ha suggerito che il loro padre avrebbe probabilmente portato la stessa cancellazione. Uno studio dettagliato è stato intrapreso sul resto della famiglia che tutti risiedevano in una piccola città nella Repubblica Dominicana. Una storia riproduttiva completa è stata suscitata dai membri adulti della famiglia. Le relazioni familiari raffigurate nel pedigree (Figura 2) sono state confermate mostrando la prevista segregazione di diversi marcatori polimorfici autosomici (dati non mostrati) per i membri della famiglia rilevanti (I-1, I-2, II-1, II-8 e II-1, II-2, III-1, III-4, III-6, III-8, III-10). Non c’erano prove di non paternità. Studi citogenetici approfonditi su membri della famiglia rilevanti (I-1, II-1, II-6, II-8, II-10, III-1, III-4, III-6, III-8, III-14, III-15, III-17, III-19 e IV-1) hanno rivelato cariotipi normali. L’analisi dello sperma è stata eseguita in sette dei 16 maschi e campioni di sangue sono stati ottenuti dalla maggior parte dei membri della famiglia.

La tabella II riassume i risultati dell’analisi dello sperma e del work-up endocrino sui membri della famiglia rilevanti. Il probando (III-8), suo padre (II-1) e due dei suoi tre fratelli (III-4, III-6) sono stati trovati per essere azoospermico o gravemente oligozoospermico. Il fratello maggiore del probando (III-1) ha rifiutato l’analisi dello sperma. Inoltre, lo zio del probando (II-8) è stato trovato per avere azoospermia e FSH elevato con testosterone basso. Come mostrato nella Figura 1, il probando, suo padre e tre fratelli sono stati tutti trovati per avere microdelezione di Yq mediante analisi PCR STS. Southern blotting con le sonde DAZ (Figura 3) e RBM (dati non mostrati) ha confermato che la cancellazione includeva il locus DAZ ma non il locus RNA Binding motif (RBM). Analisi del PESCE con il DAZ Cosmid 63C9 (Saxena et al., 1996) dei leucociti del padre del probando (II-1) hanno mostrato un’assenza uniforme del locus DAZ (Figura 4).

La scoperta che l’individuo II-8 nel pedigree era azoospermico ma non aveva una microdelezione è stata una sorpresa. Il locus DAZ in questo individuo è stato ulteriormente testato da Southern Analysis utilizzando il cDNA DAZ e un diverso enzima di restrizione (TaqI). Non ha mostrato alcuna anomalia del locus DAZ. Inoltre, i pesci con il DAZ Cosmid 63C9 hanno mostrato un’intensità normale (dati non mostrati).

Il probando (III-8) e suo fratello maggiore (III-6) stavano cercando un trattamento per l’infertilità. Dopo un’ampia consulenza, hanno optato per la fecondazione in vitro (IVF) e l’iniezione intracitoplasmatica di sperma (ICSI). Il probando (III-8) e sua moglie (III-9) hanno subito due cicli IVF-ICSI che non sono riusciti a produrre una gravidanza secondaria a una scarsa risposta ovarica. Il fratello del probando (III-6) e sua moglie (III-7) hanno subito un ciclo di iperstimolazione ovarica controllata e sono stati recuperati nove ovociti. Undici spermatozoi maturi sono stati trovati in tre eiaculati il giorno del recupero e utilizzati per ICSI. Tre ovociti fecondati che successivamente si sono spaccati e sono stati trasferiti. Ha consegnato un bambino femmina sano (IV-2).

Discussione

Riportiamo una famiglia eccezionale in cui un padre azoospermico e i suoi quattro figli infertili condividono una microdelezione Yq apparentemente identica che coinvolge il locus DAZ. La mutazione de-novo che ha portato alla microdelezione di DAZ sembra aver avuto origine nel padre del probando (II-1). Si prevede che questa cancellazione causi azoo/oligozoospermia e infertilità maschile, eppure ha concepito spontaneamente cinque figli e non era a conoscenza di alcun problema di fertilità. È interessante notare che, tuttavia, tutti e quattro i figli sono sterili e sono azoospermici o gravemente oligozoospermici.

Questa famiglia solleva diversi problemi per quanto riguarda l’associazione tra microdelezione Yq e infertilità. In primo luogo, conferma che la trasmissione verticale della microdelezione Yq è possibile e può portare alla successiva infertilità nella prole maschile. In secondo luogo, è ovvio che la stessa eliminazione può causare fenotipi diversi in individui diversi. Sebbene il padre (II-1) dei quattro ragazzi di questa famiglia fosse azoospermico al momento dell’analisi, generò il suo primo figlio all’età di 25 anni e il suo ultimo all’età di 38 anni. Così, ha posseduto un certo grado di fertilità in un ampio arco di anni. Allo stesso modo, la microdelezione del cromosoma Y, in particolare DAZ, non implica necessariamente una storia permanente di azoospermia né preclude la formazione di una grande famiglia. I suoi quattro figli, d’altra parte, sono sterili e azoospermici o gravemente oligozoospermici.

Il gene DAZ è stato proposto come fattore di azoospermia sul cromosoma Y. Questa famiglia mostra chiaramente che mentre DAZ può avere un ruolo critico nella spermatogenesi, non è essenziale per la fertilità. Inoltre, la perdita totale del cluster del gene DAZ può essere associata a un quadro istologico di “solo cellule di Sertoli” e all’arresto della maturazione degli spermatozoi (Foresta et al., 1997; Pryor et al., 1997). Diversi autori hanno trovato una scarsa correlazione tra la posizione delle microdelezioni Y (comprese le delezioni DAZ) con il fenotipo clinico e istologico dei pazienti (Reijo et al., 1995, 1996; Vogt et al.; 1996; Silber et al., 1998). I risultati di questa famiglia concordano sul fatto che tale correlazione potrebbe rivelarsi piuttosto problematica. La biopsia testicolare del fratello del probando (III-6) ha mostrato un quadro di “solo cellule di Sertoli” mentre il probando (III-8 con numero di spermatozoi 0,5×106/ml) dovrebbe chiaramente avere un certo grado di maturazione dello sperma sulla biopsia. Inoltre, la biopsia testicolare potrebbe non essere rappresentativa dell’intero testicolo perché potrebbe esserci eterogeneità geografica per la spermatogenesi come nell’individuo III-6 i cui eiaculati contenevano spermatozoi maturi.

Possiamo solo speculare sulla base delle differenze fenotipiche tra i membri della famiglia con la stessa cancellazione. È noto che eliminazioni identiche all’interno degli autosomi possono provocare fenotipi diversi (Schinzel, 1994). Si può postulare che tali differenze sono conseguenze dell’esposizione di ogni individuo al suo ambiente o all’espressione di vari geni modificanti. Un padre fertile è stato descritto con una microdelezione che si è allargata quando trasmessa al suo figlio infertile (Stuppia et al., 1996). Sebbene possano esistere estensioni variabili ai confini della delezione tra i nostri diversi membri della famiglia, queste estensioni molecolari non possono essere distinte dalla mappatura degli intervalli. Con l’analisi PCR, lo stesso STSs non è riuscito ad amplificare nei nostri cinque individui e l’ibridazione meridionale con la sonda DAZ ha confermato una completa delezione di questo cluster genico. Sebbene sia possibile che le delezioni osservate siano, infatti, non identiche e le aree adiacenti possano contenere geni importanti che modulano il grado di espressione fenotipica, questi risultati indicano ancora una grande sovrapposizione di DNA Y cancellato (inclusa la perdita di cluster di geni DAZ) in ogni individuo di questa famiglia unica.

Siamo rimasti affascinati dal fatto che lo zio del probando (II-8) ha infertilità e azoospermia ma nessuna microdelezione apparente dai test STS. Dal momento che l’analisi southern blot utilizzando sia le sonde RBM e DAZ, nonché le analisi dei PESCI utilizzando un cosmide DAZ erano tutti del tutto normali, siamo costretti a concludere che ha una diversa eziologia alla base della sua infertilità. Certo, è possibile che possa avere una mutazione/perturbazione più piccola o puntiforme o un riarrangiamento prossimale/distale che non è rilevabile dai metodi attuali. Non ha dato alcuna storia di esposizione a gonadotossine o altri fattori definibili che potrebbero influenzare la spermatogenesi.

Fino a poco tempo fa, Y microdeletion ha avuto poco significato clinico, dal momento che un uomo con una delezione non si riprodurrà, in generale,. Tuttavia, utilizzando l’ICSI e l’aspirazione dello sperma testicolare (TESA), combinata con la fecondazione in vitro, è ora possibile per gli uomini oligo/azoospermici con microdelezione Y ottenere gravidanze (Mulhall et al., 1997; Silber et al., 1998, e individuale III-6). Ciò ha favorito la preoccupazione che tali gravidanze possano produrre prole maschile con microdelezioni simili e successiva infertilità (Reijo et al., 1996; Girardi et al., 1997; Kremer et al., 1997). In effetti, la microdelezione Yq può essere trasmessa alla prole maschile tramite ICSI (Kent-First et al., 1996). La famiglia che riportiamo suggerisce che gli uomini con microdelezioni Yq (come l’individuo II-1) che raggiungono gravidanze trasmetteranno la stessa microdelezione e il rischio di infertilità ai loro figli (individui III-1, III-4, III-6, III-8). Pertanto, ai pazienti deve essere offerto uno screening della microdelezione Y prima dell’ICSI e devono essere consigliati sulla certezza di trasmettere la microdelezione Yq e possibilmente l’infertilità ai loro figli. Poiché ulteriori ricerche sono focalizzate sulle eziologie genetiche dell’infertilità maschile, l’identificazione dei geni coinvolti nella spermatogenesi dovrebbe fornire informazioni sulla fisiopatologia dell’infertilità maschile e una base più razionale per iniziare la terapia.

Si ringraziano le famiglie per la loro collaborazione nello studio; Il dottor David C. Pagina per la fornitura di DAZ sonda di cDNA e il suo inestimabile aiuto con questo manoscritto; Dr Kun Ma per fornire la MK5 (RBM1) sonda di cDNA; Dr Peter Vogt per il DNA di individui microdeleted Yq utilizzati per convalidare la nostra metodologia PCR STS; e C. C. Yu e Patricia Lanzano per la loro preziosa assistenza tecnica.

Questo studio è stato finanziato in parte dal Columbia Presbyterian Medical Center Office of Clinical Trials House Staff Awards.