Meccanismi di riarrangiamento cromosomico nel genoma umano

I DSB patologici sono definiti arbitrariamente come DSB che non servono a scopi fisiologici e possono portare a disfunzioni cellulari.

Rotture casuali del DNA dovute a radiazioni ionizzanti o radicali liberi ossidativi

In molti riarrangiamenti cromosomici, i DSB di uno o entrambi i geni sembrano essere localizzati casualmente all’interno di ampie regioni di molte kilobasi. Il posizionamento casuale e l’apparente mancanza di propensione alla sequenza sono indicativi di meccanismi DSB non specifici della sequenza come i radicali liberi ossidativi, le radiazioni ionizzanti o, meno comunemente, l’idrolisi spontanea della spina dorsale del DNA.

Circa la metà delle radiazioni ionizzanti naturali dell’ambiente proviene da metalli pesanti naturali della terra, come uranio, torio e persino potassio. L’altra metà della radiazione ionizzante emana dalla radiazione cosmica che non è completamente bloccata dall’atmosfera. In totale, circa 3 x 108 particelle di radiazioni ionizzanti passano attraverso ognuno di noi ogni ora, producendo radicali liberi idrossilici dall’acqua nella loro scia. Questo tratto di radicali liberi idrossilici provoca danni cluster sul DNA, rompendo così entrambi i filamenti di DNA.

Circa lo 0,1% dell’ossigeno che respiriamo viene convertito in radicali liberi . Questo genera 3 x1022 radicali liberi all’ora all’interno di ciascuno di noi, e questi radicali liberi dannosi sono distribuiti attraverso le 1014 cellule del corpo umano. I radicali liberi causano prevalentemente danni al DNA a singolo filamento, ma due eventi simili nelle vicinanze possono causare un DSB.

Azione RAG in siti RSS criptici in posizioni off-target in modo specifico della sequenza: V (D)Interruzioni di tipo J

La sequenza di consenso RSS heptamer/nonamer non è affatto unica per i loci Ig e TCR, e il complesso RAG può tagliare in siti che differiscono sostanzialmente dal consenso di 16 bp . Il motivo minimale per intaccare lo straccio è solo CAC. Così il complesso dello STRACCIO può agire ai siti del locus del ricevitore del non antigene di RSS-like, definiti RSS criptico (cRSS). Ciò si verifica in molti dei riarrangiamenti osservati nel linfoma linfoblastico acuto a cellule T umane . In questi casi, invece del complesso RAG accoppiare un 12-RSS con un 23-RSS, un 12-RSS coppie con un 23-cRSS o un 23-RSS coppie con un 12-cRSS. Chiamiamo queste interruzioni di tipo V(D)J perché si verificano attraverso lo stesso meccanismo della normale ricombinazione di V(D)J, indipendentemente dal fatto che uno dei siti sia al di fuori dei soliti loci del recettore dell’antigene (cioè, è fuori bersaglio).

Azione RAG a strutture di bolle di DNA e altre regioni di eterologia in modo specifico per la struttura

Oltre alla sua modalità di taglio specifica per la sequenza, il complesso RAG può anche nick in modo specifico per la struttura nei siti di transizione da dsDNA a ssDNA, come avviene ai bordi delle strutture di DNA a bolle o Tale attività da parte del complesso RAG può essere sorta perché il complesso RAG è abituato a creare strutture tornanti, che comporta una sostanziale distorsione del DNA. Quindi, qualsiasi regione di disallineamento o slittamento è un potenziale bersaglio per il nicking da parte del complesso di STRACCI nelle cellule linfoidi.

Trasposizione mediata dal RAG come meccanismo per il riarrangiamento cromosomico

Dal 1998 al 2007, diversi laboratori hanno proposto che il complesso RAG potesse inserire le estremità smussate contenenti RSS dalla ricombinazione V(D)J, chiamate estremità del segnale, in nuove posizioni nel genoma. Ciò è chiamata trasposizione dello STRACCIO e accade ad un livello basso facendo uso di una forma troncata delle proteine dello STRACCIO chiamate stracci del centro (esaminato dentro ). Tuttavia, gli sforzi per trovare eventi di trasposizione RAG in vivo hanno dimostrato che questi erano molto meno comuni dell’integrazione casuale del DNA . Infine, non ci sono esempi di neoplasie linfoidi umane (o qualsiasi altro tipo di malignità) in cui il genoma è stato alterato da un inserimento trasposizionale di stracci di estremità del segnale (o qualsiasi altra variante apparente di tale trasposizione).

Azioni di aiuto in località fuori bersaglio

Come menzionato nella discussione di cui sopra sulla ricombinazione del cambio di classe, gli AIUTI possono convertire C in U o metil C o T in qualsiasi regione di ssDNA. Ciò sembra verificarsi non solo nelle sequenze di switch e nei domini variabili dei loci Ig, ma anche in alcune posizioni patologiche, come alcuni oncogeni come c-myc . Se prese di mira dagli AIUTI, queste regioni possono sostenere mutazioni puntiformi o DSB . L’azione di aiuto nella regione di switch IgH durante la CSR e l’azione di AIUTO indipendente presso il gene c-myc per creare un DSB sono considerati alla base dei due DSB inizianti nelle traslocazioni c-myc sia nel topo che nell’uomo . Si potrebbero considerare le interruzioni di questo tipo come interruzioni di tipo CSR (come menzionato sopra nella discussione sulla ricombinazione degli switch di classe) o interruzioni di tipo SHM, dove SHM si riferisce ad eventi avviati dagli AIUTI del tipo simile a quello che normalmente si verifica nell’ipermutazione somatica.

Azione combinata putativa di AIUTI e stracci nei siti CpG: interruzioni di tipo CpG

Recentemente, abbiamo riportato che i DSB in determinati loci nelle traslocazioni di stadio pro-B/pre-B-il bcl – 2 da t(14;18), il bcl-1 da t(11;14) e E2A da t (1; 19) – hanno una forte propensione a verificarsi nella sequenza dinucleotidica CpG .

La traslocazione bcl-2 è la traslocazione più comune nel cancro, che si verifica in > 90% dei linfomi follicolari e un terzo dei linfomi diffusi a grandi cellule. Il cinquanta per cento delle interruzioni al gene bcl-2 si verificano all’interno della regione di breakpoint maggiore (MBR), che è un hotspot di 175 bp nel 3′ più esone nella regione che codifica il 3 ‘ UTR. Due hotspot meno frequentemente utilizzati si trovano 18 e 29 kb più distali al gene bcl-2, la regione del cluster intermedio bcl-2 105 bp (icr) e la regione del cluster minore bcl-2 561 bp (mcr), rispettivamente. Uno qualsiasi dei siti CpG all’interno di una qualsiasi di queste tre zone di traslocazione bcl-2 può essere un bersaglio per un DSB . Il tredici percento delle interruzioni di traslocazione bcl-2 si trova nell’icr e il 5% nell’mcr.

L’uso di CpGs si applica anche al cluster di traslocazione principale bcl-1, che è la posizione coinvolta nella traslocazione t(11;14). La traslocazione bcl-1 si verifica in quasi tutti i linfomi delle cellule mantellari, con il 30% delle interruzioni che si verificano nel cluster di traslocazione principale bcl-1 (MTC) di 150 bp.

Le interruzioni di tipo CpG si verificano anche in una terza neoplasia linfoide, la t(1;19) in una piccola percentuale di pre-B ALLs, una traslocazione che si verifica tra il gene Pbx1 e il gene E2A. Le interruzioni del gene E2A si verificano in una zona di soli 23 bp e questi DSB sono anche significativamente raggruppati attorno ai siti CpG . Tutte e tre le traslocazioni che coinvolgono bcl-2, bcl-1 ed E2A si verificano allo stadio pro-B/pre-B dello sviluppo delle cellule B.

Il bcl-2 MBR è reattivo con una sonda chimica per single-strandedness chiamato bisolfito . Come il bcl-2 MBR, questo bcl-1 MTC è relativamente piccolo (150 bp) e presenta una reattività simile al bisolfito . Queste zone reattive altamente bisolfito sono ricchi di piste di Cs. Sulla base di dicroismo circolare, cristallografia a raggi X, NMR e sondaggio chimico, tali cicli di Cs tendono ad adottare una struttura del DNA che è intermedia tra il DNA B-form e il DNA A-form, chiamato B/A-intermedio . La struttura B / A-intermedia ha una cinetica di apertura più rapida, forse rappresentando parte dell’aumento osservato nella reattività del bisolfito. Tali regioni insolite del DNA possono essere più inclini agli eventi di slittamento, forse indotti dalla replicazione o dalla trascrizione del DNA. Ciò può quindi spiegare la loro vulnerabilità nei test di ricombinazione minicromosomiale .

Il Cs del CpGs all’interno o direttamente adiacente a queste zone intermedie B/A è a maggior rischio di deaminazione . Questa deaminazione non si applica a tutti i Cs nella regione, ma solo ai Cs che si trovano all’interno dei siti CpG. L’unica caratteristica distintiva di tali Cs all’interno di CpGs è che possono essere metilati dalla DNA metiltransferasi. Quando regolare Cs deaminate, diventano U, con conseguente disallineamento U: G. Ma quando metil Cs deaminato, diventano T, con conseguente T: G mancata corrispondenza. La riparazione dei disallineamenti U:G è molto efficiente, ma la riparazione dei disallineamenti T:G non è efficiente. In effetti, la riparazione della mancata corrispondenza T:G è così inefficiente, rappresenta circa la metà delle mutazioni puntuali del gene p53 in una vasta gamma di tumori umani. Questi siti di mancata corrispondenza T: G sono sempre in siti CpG.

Che cosa causa l’interruzione in questi siti di mancata corrispondenza T: G? È interessante notare che questa deaminazione in questi hotspot di traslocazione linfoide sembra verificarsi nella fase pre-B della differenziazione. Questo è lo stadio dello sviluppo delle cellule B quando la ricombinazione da D a J si verifica più vigorosamente. Poiché le traslocazioni bcl-2 e bcl-1 si verificano in questa fase, questo sembra essere probabilmente lo stadio della traslocazione. Abbiamo dimostrato che il complesso RAG può causare un DSB in siti di piccole strutture a bolle e persino disallineamenti di coppie di basi singole. (Come accennato in precedenza, questa azione del complesso RAG riflette la sua attività nucleasica specifica per la struttura, forse una caratteristica che riflette le azioni specifiche per la struttura del complesso RAG durante la fase di formazione dei tornanti della ricombinazione V(D)J.) Pertanto, abbiamo proposto che il complesso RAG renda i DSB nei siti di disallineamento T:G.

Se il complesso RAG causa i DSB nei siti CpG, allora perché tali interruzioni di tipo CpG non si verificano nelle cellule pre-T, che esprimono anche il complesso enzimatico RAG? Il lignaggio delle cellule B esprime una deaminasi citidina per la ricombinazione degli interruttori di classe e l’ipermutazione somatica. Come accennato in precedenza, questo enzima è chiamato deaminasi indotta dall’attivazione (AID). L’AIUTO è espresso in cellule B ma non in altre cellule somatiche. L’AIUTO è più altamente espresso nelle cellule B quando sono nei centri germinali. Tuttavia, un basso livello di espressione di AIUTO è stato descritto nelle cellule pre-B. Inoltre, le cellule B che lasciano solo il midollo osseo, chiamate cellule B di transizione, sono anche pensate per esprimere un AIUTO . Pertanto, vi è un periodo di tempo in cui le cellule B stanno completando la ricombinazione V(D)J e iniziano a esprimere AIUTI quando sia l’AIUTO che il complesso RAG sono presenti nelle cellule B. È stato dimostrato che gli AIUTI sono in grado di deaminare il metil C a T. Pertanto, proponiamo che gli AIUTI siano probabilmente responsabili della mutazione di meC a T nei siti CpG nelle prime cellule B. La mancata corrispondenza T:G risultante viene quindi tagliata dal complesso RAG, risultando in un DSB. Questo modello spiega tre picchi di traslocazione situati all’interno del bcl-2 MBR, che sono tutti centrati in siti CpG .

Altre cause di DSBs patologico di meccanismo sconosciuto

Alcune traslocazioni sono fortemente associate alla terapia con inibitori della topoisiomerasi di tipo II . Dopo tale terapia, alcuni pazienti sviluppano neoplasie secondarie con queste traslocazioni caratteristiche. Le topoisomerasi in generale fanno rotture a singolo o doppio filamento per avvolgere o svolgere il DNA, quindi hanno un’attività nucleasica come parte della loro funzione. Dopo l’avvolgimento o svolgimento del DNA, normalmente richiudere la rottura(s). È stato proposto che l’interruzione o la prevenzione della risigillatura possano provocare rotture stabili osservate nei riarrangiamenti cromosomici .

Alcuni DSB sorgono in siti vicini a ripetizioni di DNA dirette o invertite. Tali ripetizioni possono dare origine a strutture di DNA scivolate contenenti regioni di DNA a filamento singolo, che possono essere bersagli per la scissione. Il miglior esempio di ciò è la traslocazione costituzionale t (11;22) (q23; q11), che contiene un palindromo ricco di diverse centinaia di basi, con potenziale di formazione cruciforme.

Combinazione di più meccanismi DSB all’interno di un riarrangiamento

Dato che sono necessari due DSB per generare una traslocazione, le due interruzioni spesso non sono correlate tra loro. Nelle traslocazioni bcl-2 e bcl-1, ad esempio, l’interruzione nel locus IgH è un’interruzione di tipo V(D)J generata dall’azione specifica della sequenza del complesso RAG durante la ricombinazione V(D)J. (Si potrebbe considerare questo un fallimento nel completamento del normale processo di ricombinazione V(D)J.) Il DSB nel locus bcl-2 o bcl-1 è una rottura di tipo CpG che è stata proposta per essere dovuta all’azione sequenziale dell’AIUTO e all’attività di nicking specifica della struttura del complesso RAG .

Anche all’interno di un determinato locus, ci può essere una vasta gamma di meccanismi DSB. I loci SCL e LMO2 sostengono prevalentemente i DSB di tipo V(D)J, ma un terzo o più dei DSB sono incompatibili con i requisiti di sequenza per i DSB di tipo V(D)J e questi possono essere dovuti a danni da radicali liberi, radiazioni ionizzanti o guasti della topoisomerasi. Loci diversi all’interno di una singola cella sono quindi soggetti a diversi tipi di meccanismi DSB.

DSB indotti dalla replicazione

Durante la replicazione del DNA, le delezioni possono insorgere a causa dello slittamento del filamento di sintesi sul filamento del modello. I riarrangiamenti cromosomici che si verificano in punti caldi specifici, sia nel cancro nelle cellule somatiche o durante la gametogenesi / divisioni di sviluppo iniziali come traslocazioni costituzionali, sono chiamati traslocazioni ricorrenti che possono essere viste in molti pazienti. Le traslocazioni non correnti sono quelle che si verificano in luoghi diversi da un paziente all’altro, ma alterano o inattivano un gene che causa una malattia. A differenza delle traslocazioni ricorrenti che abbiamo discusso in cancer sopra, i meccanismi che causano lo scambio di filamenti nelle traslocazioni non correnti sembrano coinvolgere la commutazione del modello durante la sintesi replicativa del DNA. Questi interruttori modello possono verificarsi in piccole regioni di omologia sequenza del DNA, come 5 bp. Questa commutazione del modello è stata chiamata replica indotta da rottura mediata da microhomology (MMBIR) o stallo della forcella e commutazione del modello (FoSTeS). Per le giunzioni di traslocazione non correnti che coinvolgono diversi lunghi tratti di sequenza da regioni del genoma normalmente separate l’una dall’altra, sono stati proposti più eventi di commutazione del modello come meccanismo .