Il laboratorio diagnostico veterinario di stato, il Texas A & M Veterinary Medical Diagnostic Laboratory, TVMDL, testa centinaia di migliaia di campioni all’anno. Tuttavia, sull’orlo della stagione di caccia al cervo di ogni anno, i numeri di test cominciano a picco come la domanda di malattia del deperimento cronico, CWD, test aumenta.
Che cosa è la malattia del deperimento cronico?
La CWD è una malattia neurologica progressiva che colpisce diverse specie di cervidi. Le specie sensibili al CWD sono cervi dalla coda bianca, cervi dalla coda nera, cervi mulo, alci, cervi rossi, renne, sika e alci. Da quando è stato segnalato per la prima volta nel 1967, è stato documentato in specie di cervidi sia in cattività che in libertà in 25 stati e tre province canadesi.
CWD ha guadagnato una certa attenzione negli ultimi anni come rapporti di una “malattia dei cervi zombie” emerse e si diffuse attraverso vari media. Anche se accattivante, “zombie deer disease” è in realtà un termine improprio poiché gli animali afflitti da CWD non sono morti. Una volta colpiti, possono essere necessari da due a quattro anni prima che l’animale infetto inizi a mostrare segni clinici, che possono imitare il comportamento “simile a uno zombie” mentre la malattia progredisce. Gli animali affetti mostrano segni come perdita di peso, sbavando, inciampando e stupore. Questa combinazione di segni clinici culmina in un animale che sembra “sprecare”, coniando il nome effettivo della malattia.
Simile all’encefalopatia spongiforme bovina, BSE, nei bovini e nella scrapie negli ovini e nei caprini, la CWD è un’encefalopatia spongiforme trasmissibile naturale, TSE o malattia da prioni. I prioni sono proteine anormali ed estremamente difficili da distruggere. Una volta infettati, i prioni inizialmente colpiscono i linfonodi dell’animale e dopo la diffusione attraverso il corpo, alla fine infettano il cervello.
Nel 2012, CWD è stato scoperto per la prima volta in Texas in cervi mulo liberi nelle montagne Hueco. Da allora, la malattia ha continuato ad essere rilevata nelle regioni del Texas occidentale e del Panhandle in cervi di mulo, cervi dalla coda bianca e alci.
Sebbene la storia del Texas di CWD sia stata breve rispetto ad altri stati, i test diagnostici continuano ad aumentare man mano che le agenzie statali tentano di controllare la malattia. In Texas, TVMDL è l’unico laboratorio approvato per testare la CWD.
Submitters CWD: Chi sono?
L’anno scorso, TVMDL ha eseguito circa 26.500 test CWD. Del numero totale di test, quasi la metà è stata eseguita da ottobre a dicembre. Questo aumento delle osservazioni CWD coincide con la stagione di caccia al cervo in Texas.
I cacciatori devono rispettare alcune linee guida durante la stagione dei cervi a causa di Texas Parks and Wildlife Department, TPWD, programmi volti a mitigare la diffusione di CWD. Ad esempio, se un cervo viene ucciso in una zona in quarantena CWD, i campioni devono essere raccolti e presentati per il test CWD. La raccolta dei campioni viene condotta presso le stazioni di controllo dei cacciatori, gli impianti di lavorazione dei cervi e, a volte, i tassidermisti.
Le richieste di test CWD sono presentate da agenzie statali, come TPWD e la Texas Animal Health Commission, TAHC e allevatori di cervi. TVMDL fornisce un servizio a queste agenzie e all’industria dei cervi per aiutare con gli sforzi in corso per monitorare la diffusione di malattie come la CWD.
Rilevamento della malattia
Una volta in laboratorio, TVMDL analizza i campioni attraverso uno dei due metodi: saggio immunoassorbente legato all’enzima, ELISA o immunoistochimica, IHC. Entrambi i metodi di prova richiedono tessuti recuperati da entrambi i linfonodi di un cervo o obex.
Test ELISA
Il metodo più richiesto è il test ELISA. Questo metodo è l’opzione più sensibile perché utilizza tessuti freschi rispetto ai tessuti fissati in un agente conservante. L’intero processo, escluso il tempo di preparazione del campione, richiede in genere circa tre ore. Una volta che un campione arriva nella sezione sierologia a TVMDL, inizierà la prima delle tre fasi: preparazione del campione.
Durante la preparazione del campione, i volumi precisi e le posizioni anatomiche dei tessuti linfonodali e/o obex vengono tagliati e collocati in tubi di macinazione unici. I tubi sono posti su uno strumento omogeneizzatore che liquefa i tessuti e li prepara per la seconda fase di test, la purificazione.
La fase di purificazione è semiautomatica. Uno strumento di manipolazione del liquido inizia con l’elaborazione del campione. Questo processo digerisce prioni normali usando la proteinasi K e lascia dietro di sé prioni che causano malattie, se presenti. Successivamente, il prodotto finale liquido del processo di purificazione viene centrifugato per formare un pellet. Il pellet viene trattato una seconda volta e quindi diluito. Il pellet passerà quindi alla fase finale del test e determinerà se sono presenti prioni CWD.
Il rilevamento è la fase finale del processo di test ELISA. In questa fase, il pellet campione diluito viene testato utilizzando un ELISA sandwich. Un ELISA sandwich utilizza due strati di anticorpi per determinare la concentrazione di un particolare antigene, in questo caso il prione CWD. Durante il processo viene aggiunto un substrato che cambia colore come indicatore visivo della presenza di prioni CWD nel campione. Se un campione sviluppa un cambiamento di colore significativo, è considerato un” reattore iniziale”, IR, e viene nuovamente testato. I campioni IR che indicano ancora la presenza di prioni CWD dopo il nuovo test vengono inoltrati al Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Uniti-Animal and Plant Health Inspection Service, USDA-APHIS, National Veterinary Services Laboratory.
Test IHC
La seconda opzione di test CWD di TVMDL, IHC, utilizza tessuti fissi o conservati. Se i tessuti arrivano a TVMDL freschi o non ben fissati, viene aggiunto un giorno al processo per consentire il tempo per i tessuti da fissare in formalina fino a quando non sono pronti per il test.
Una volta ben fissati, i tessuti vengono inseriti in cassette di plastica etichettate singolarmente. Le cassette sono necessarie per la fase successiva in cui i tessuti vengono trattati per circa 13 ore. Durante questo periodo, i tessuti vengono disidratati e tutta l’acqua viene sostituita con cera di paraffina per preservare la struttura cellulare del tessuto.
Dopo la lavorazione, i tessuti vengono incorporati in uno stampo di paraffina per prepararli al sezionamento utilizzando un microtomo. Questo strumento taglia il blocco di tessuto ceroso in sezioni spesse 5 micron, più sottili di una ciocca di capelli umani.
La sezione sottile del tessuto è montata su un vetrino. Dopo l’essiccazione durante la notte, i vetrini vengono preparati per la colorazione. I vetrini sono trattati per rimuovere la paraffina e garantire siti di legame antigene sono disponibili durante il processo di colorazione. Questo processo identifica gli antigeni CWD nel tessuto legando una molecola anti-prione all’antigene CWD nel tessuto positivo e quindi legando un cromogeno rosso a quella molecola.
Questo processo di colorazione semiautomatico richiede circa sei ore totali; due ore di lavoro manuale e quattro ore automatizzate. Durante questo lasso di tempo, i tre strumenti di colorazione possono macchiare 90 vetrini. Quando la colorazione è completa, tutti i vetrini sono coperti e dati ai patologi TVMDL che ispezionano microscopicamente ogni vetrino per la presenza di CWD.
Simile al metodo ELISA, se un campione è sospettato di avere CWD, viene inviato al National Veterinary Service Laboratory di Ames, Iowa per test di conferma e una diagnosi finale.
La differenza TVMDL
Sebbene altri laboratori negli Stati Uniti offrano test CWD, TVMDL si distingue attraverso la sua dedizione agli individui nell’industria dei cervi del Texas. L’agenzia lavora a stretto contatto con altre agenzie statali e allevatori di cervi per stabilire rapporti di lavoro e connessioni personali.
Per ulteriori informazioni sui test CWD su TVMDL, visitare tvmdl.tamu.edu oppure chiamare il laboratorio College Station al 1-888-646-5623.