Lettere oncologiche

Introduzione

Il cancro polmonare è il cancro più comune dopo il cancro al seno e al colon, in tutto il mondo (1). L’incidenza del cancro del polmone è simile ai tassi di mortalità per questa malattia a causa dell’elevata mortalità del cancro del polmone. Secondo i dati disponibili dall’Agenzia internazionale per la ricerca onCancer, le morti annue per cancro al polmone dovrebbero aumentare a circa 10 milioni entro il 2030 (2).Il tipo più comune di cancro del polmone istologicamente èadenocarcinoma, che rappresenta quasi il 50% di tutti i tumori polmonari(3).

Istologicamente ci sono due tipi principali di lungcancer, carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) e non-SCLC (NSCLC). La SCLC rappresenta circa il 20% di tutti i casi di cancro ai polmoni, mentre la SCLC rappresenta quasi l ‘ 80% dei casi di cancro ai polmoni (4). Esistono tre sottotipi istologici diNSCLC: i) carcinoma a cellule squamose (SCC), ii) adenocarcinoma, eii) carcinoma polmonare a grandi cellule, ciascuno dei quali rappresenta rispettivamente il 25, il 40 e il 15% dei casi totali di NSCLC (5).

Nonostante il riconoscimento del cancro del polmone come uno dei tipi di cancro più aggressivi, vi è un lento progresso nei risultati clinici, anche se è disponibile un gran numero di nuovi farmaci. Le questioni più importanti per questo inconveniente nella gestione clinica del cancro del polmone è l’indisponibilità di marcatori tumorali del siero convalidati, che sono utili sia nella diagnosi cheprognosi della malattia (6). Manytypes di malignità causano versamenti pleurici, e cancri che mostfrequently metastasize alla pleura sono polmone e carcinoma mammario e linfomi. Anche se l’esame citologico di pleuraleffusion è considerato un approccio standard per la diagnosi, itssensitivity è tipicamente solo 50-70% (7,8).

Un certo numero di marcatori tumorali, tra cui l’antigene carcinoembrionico (CEA), l’antigene di carboidrati 125 (CA125) e CYFRA21-1, un frammento di citocheratina 19 (CK19), sono stati valutati come marcatori tumorali migliori e più accurati nel siero e nel liquido pleurico in molti studi (7,8). È stato anche osservato che una combinazione di due o più marcatori è più potente di un singolo marcatore. Tuttavia, il vero potere di predittività della diagnosi di questi marcatori non è stato valutato in molti diquesti studi, poiché la presenza citologica di cellule tumorali è stata rilevata nei versamenti pleurici dei pazienti (9-11). Molti dei suddetti marcatori sono risultati elevati nelle effusioni pleuriche dei pazienti oncologici rispetto alle effusioni pleuriche benigne (7). Le cellule tumorali del polmone umano derivate dall’effusione pleurica sono risultate più invasive e metastatiche rispetto alle cellule tumorali da lesioni primarie e questa differenza può essere correlata alla transizione epiteliale-mesenchimale(EMT).

L’EMT, che di solito svolge un ruolo importante nella morfogenesi del tessuto embrionale e nella fibrosi post-lesione(12,13), viene riattivata in modo inappropriato durante l’età adulta in determinate condizioni patologiche come il cancro e contribuisce alla metastasi tumorale (13). EMT è noto per mediare i manyalterations e la modulazione fenotipo risultante in tumorarchitecture. EMT è caratterizzato dalla rottura dell’adesione intercellulare, elevata motilità delle cellule tumorali, diminuitasuscettibilità all’anoikis e all’apoptosi e nel rilascio di celluledal tessuto epiteliale (9-11). Le cellule tumorali rilasciate, che areresistant ad anoikis, assumono il fenotipo mesenchymal-simile che issuitable per migrazione, invasione e disseminazione, allcontributing a progressione metastatic. In molti casi, il gradodi EMT delle cellule tumorali determina la gravità del cancro (14). EMT è stato anche dimostrato di essere coinvolto nella resistenza a anoikis, che è fondamentale nelinibizione di metastasi del cancro in vari tumori solidi (15).

Le citocheratine (CKS) sono marcatori tumorali comuni e sonoi principali elementi strutturali del citoscheletro nelle cellule epiteliali e, sulla base delle proprietà strutturali CKS, ci sono 20 sottotipi. Di questi, CK19 è un tipo solubile e acido I CK e isexpressed nel rivestimento dell’epitelio dell’albero bronchiale e isknown per essere overexpressed nei tessuti del cancro del polmone (16). C’è degradazione elevata di CK19 inneoplastically ha trasformato le celle epiteliali dovuto l’attività di incaspase-3 aumentata ed i frammenti proteolitici, particolarmente,CYFRA21-1, sono rilasciati nel sangue. Si ritiene che la CK19 sia strettamente associata al cancro del polmone; tuttavia, alcuni studi hanno segnalato che l’espressione di CK19 è negativa in alcuni tumori del polmone (9-11). L’espressione di CK19 in alcune linee cellulari del cancro del polmone è stata ridotta a seguito del fattore di crescita trasformante (TGF)-EMT indotto da β (17). I livelli circolanti di frammenti di CK19 tra cui CYFRA21-1 probabilmente riflettono l’estensione della formazione citoscheletrica nelle cellule tumorali e possono anche associarsi al grado di differenziazione tumorale verso l’epitelio squamoso (16).

Nel presente studio sono stati impiegati campioni tumorali di 111 pazienti affetti da lungocancro e sono stati studiati l’incidenza di CK19-negativi espressi in diversi tipi di cancro ai polmoni, nonché se l’induzione di EMT nelle cellule focali primarieinfluenza l’espressione di CK19. Abbiamo anche esaminato se i tumori polmonari K19-negativi fossero più invasivi e metastatici.

Pazienti e metodi

Generale

Tutti i 111 pazienti sono stati selezionati in base alla stadiazione TNM 7thversion, descritta dall’American Joint Committee onCancer and Union for International Cancer Control nel 2007 (9-11). Nel presente studio sono stati reclutati pazienti affetti da Lungcancer con diagnosi di diversi tipi di carcinoma polmonare allo stadio IV e trattati con inibitori della tirosina chinasi o platino(75 mg/m2) e docetaxel (75 mg/m2). I pazienti sono stati ammessi all’ospedale del popolo Subei tra gennaio 2013 e dicembre 2014.

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Subei People’s Hospital. È stato ottenuto il consenso informato scritto da ciascun partecipante. Questo studio è conforme al “Codice Etico dell’Associazione Medica Mondiale” (Dichiarazione di Helsinki, 1964).I 111 pazienti comprendevano 90 uomini(44-82 anni) e 21 donne (40-75 anni). Le caratteristiche del paziente sono mostrate nella Tabella I. Sono stati identificati un totale di 56 casi di adenocarcinoma, 21SCC, 32 SCLC e 2 casi di carcinoma adenosquamoso.I pazienti arruolati corrispondevano ai seguenti criteri: Karnofskyscore con un > 60 anni di aspettativa di vita di > 3 mesi, nessuna malattia del sistema immunitario, elettrocardiogramma normale, fegato normale e kidneyfunction, e non riceve terapia antitumorale entro un mese priorto lo studio. I casi trattati con inibitori della tirosina chinasi erano del tipo adenocarcinoma.

I campioni di sangue sono stati raccolti da tutti i pazientie i sieri sono stati separati e congelati fino all’analisi successiva.I campioni di versamento pleurico sono stati raccolti seguendo le procedure approvate e sono stati esaminati citologicamente ed elaborati perimmunoistochimica.

Immunoistochimica

Sono stati elaborati campioni di tessuto tumorale (focolai primari) per l’immunoistochimica per la rilevazione di CK19, E-caderina evimentina. I campioni di tessuto focus primario sono stati fissati in formalina e incorporati in blocchi di paraffina. Sezioni multiple (4 µm) da ciascunocampione sono stati utilizzati per l’analisi immunoistochimica. I campioni werestained con ematossilina ed eosina. Gli anticorpi anti-CK19, anti-E-caderina e anti-vimentina sono stati acquistati da TIYO BiotechnologyCorporation (Shanghai, Cina). Anticorpo policlonale del coniglio anti-CK19 (catalogo no. Z98123) è stato utilizzato ad una diluizione di 1: 50;anti-E-caderina CK19 coniglio policlonale(catalogo no. Z86603) anticorpo è stato utilizzato ad una diluizione di 1: 100; e anti-vimentin CK19rabbit anticorpo policlonale (catalogo no. Z40651) è stato utilizzato a adilution di 1: 500, seguita da incubazione con rafanoperossidasi-coniugato anti-IgG (Beijing CellChip Biotechnology Co.,Ltd., Pechino, Cina) ad una diluizione di 1:100. Lo sviluppo del colore è statoeseguito utilizzando un substrato di 3,3 ‘ – diamminobenzidina.

Comparsa di particelle di abbronzatura nella membrana cellulare ecitoplasma è stato considerato positivo per CKl9, E-caderina evimentin, rispettivamente. I risultati immunoistochimici sono stati confermatida due patologi usando un metodo in doppio cieco.

Analisi dei marcatori

Un analizzatore automatico di chemiluminescenza (Roche Diagnostics, Basilea, Svizzera) di Roche E601 Cobas è stato utilizzato per misurare CEA, CA125, enolasi neurone-specifica (NSE),α-fetoproteina (AFP) e CYFRA21-1 nei sieri del paziente e nelle effusioni pleuriche. CYFRA21-1 >3,3 ng/ml, NSE >15,2 ng/ml, CEA >5,0 ng/ml, CA125 >35,0 ng/ml e AFP >7 ng/ml sono stati considerativalori positivi.

EMT indotta da TGF-β1 in cellule tumorali polmonari

Le cellule tumorali sono state isolate dai tessuti a fuoco primario ottenuti dai pazienti. Le cellule primarie sono state isolate dal tessuto tumorale primario e dal versamento pleurico dello stesso paziente e sono state coltivate. Le cellule sono state isolate in due fasi: i) centrifugazione attraverso mezzo di separazione linfocitaria (specificgravità di 1.077), seguita da coltura in media RPMI-1640 contenente siero bovino fetale al 20% (Beijing LabLead BiotechnologyCorporation, Pechino, Cina) per 2 giorni. ii) Successivamente 40/20% Percoll (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Pechino, Cina) è stato utilizzato come secondo passo centrifugazione forseparating le cellule. Le cellule raccolte sono state nuovamente coltivate nel terreno di coltura RPMI-1640 contenente il 20% di siero bovino fetale e incubato a 37°C sotto il 5% di atmosfera di CO2 fino alla confluenza del 70-80%. Le cellule sono state trattate con TGF-β1 (acquistato Dashanghai Kexing Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina) a 5 ng / ml for24 h. Le cellule sono state poi lavate e lavorate. L’analisi immunoistochimica per E-caderina, CK19 e vimentina, è stata eseguita prima e dopo il trattamento con TGF-β1, come descritto sopra. Presenza o assenza di questi marcatori è stata valutata come positiva o negativa,rispettivamente.

Analisi statistica

P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Risultati

Caratteristiche del paziente

I 111 pazienti comprendevano 90 uomini e 21 donne, con una distribuzione per età simile (40-80 anni). I pazienti eranodiagnosticati con carcinoma polmonare allo stadio IV. Istologicamente, la maggior parte dei casi erano di tipo adenocarcinoma, seguiti da SCLC e SCC, sia nei pazienti di sesso maschile che femminile (TableI). Ci sono stati solo due casi di carcinoma adenosquamoquesto campione di paziente. La maggior parte dei pazienti ha ricevutochemoterapia, a base di chemioterapia a base di platino e docetaxel, mentre quelli con mutazioni del recettore del fattore di crescita epidermico gain-of-function sono stati somministrati in terapia con inibitori della tirosin chinasi (TKI) (Gefitinib). Solo un piccolo numero di pazienti (5 uomini e 1 donna)non ha ricevuto queste terapie a causa di vincoli finanziari.

Istologia del tumore primariotessuto

I tessuti tumorali di 111 pazienti sono stati esaminatiimmunoistochimicamente per l’espressione di CK19. Mentre è stata osservata un’elevata espressione di CK19 in alcuni tumori polmonari, una perdita di CK19 è strettamente associata a EMT (17). Nel presente studio, l’espressione di CK19 era assente in molti tumori SCLC,>50% negli uomini e 100% nelle donne. Come tale, l’espressione di CK19 è diminuita in modo correlato nei tumori SCLC rispetto ad altri lungcancers (Fig. 1). Tra gliadenocarcinomi, circa il 31% dei tumori dei pazienti maschiierano negativi per CK19, che era molto più basso per le donne (7%).Nel complesso, i tessuti tumorali SCLC hanno mostrato una maggiore probabilità di EMTcaratteristiche (Tabella I). C’è stata un’apparente riduzione della proporzione di tumori primari espressi CK19-negativi e delle cellule di versamento pleurico dopo la TKIterapia, rispetto ai tumori del paziente non trattati o trattati con chemioterapia, in tutti i tipi di cancro del polmone (Fig. 2).

Livelli di CYFRA21-1

Siero e versamento pleurico I livelli di CYFRA21-1 sono considerati importanti marcatori di malignità per molti tipi di cancro, in particolare per il cancro del polmone. Poiché CYFRA21-1 è afragment di CK19, abbiamo esaminato il siero e i livelli pleuricyfra21-1 di effusionCYFRA21-1 come funzione di perdita di espressione di CK19 inle cellule di effusione pleuriche. I risultati hanno mostrato che quando CK19 è statoespresso fortemente nel focus primario e nelle cellule di versamento pleurico, i livelli di CYFRA21-1 erano alti e quando l’espressione di CK19 era persa nei tumori primari e / o nelle cellule di versamento pleurico, i livelli di CYFRA21-1 sono diminuiti significativamente in tutti i tipi di cancro (Fig. 3). Inoltre, i livelli di CYFRA21-1 eranomolto più alti nel siero e nel versamento pleurico dei pazienti con tumori CK19-positivi SCC rispetto ad altri tipi di tumori (Fig. 2). Gli alti livelli diCYFRA21-1 nei sieri del paziente SCC e nel versamento pleurico probabilmente riflettonola forte presenza di CK19 nei tumori positivi (Fig. 1). I risultati hanno anche suggerito che i livelli di siero CYFRA21–1 erano elevati solo marginalmente nei polmoni rispetto ai livelli di base benigni (1,3-2,6 ng/ml) con l’eccezione di SCC, dove l’aumento era molto al di sopra della gamma normale (Fig. 3). Tuttavia, i livelli di CYFRA21–1 sono stati notevolmente elevati al di sopra dell’intervallo benigno (6,5-35 ng/ml)(18) nel versamento pleurico dei pazienti affetti da cancro polmonare, suggerendo che la misurazione del versamento pleurico di CYFRA21-1 è un marcatore tumorale ottimale.

Altri marcatori sierici

I marcatori di malignità tumorale inclusi CA125, CEA,NSE e AFP sono stati misurati nei sieri di alcuni pazienti e vi è stata una notevole variazione tra i pazienti e i livelli.Pertanto, per i pazienti con ADC, la media di CA125, CEA, NSE e AFPERA 23.6±10.9, 48.3±39.7, 10.1±2.4, e 2.1±0.6, rispettivamente. Per i pazienti con SCC, la media di CA125, CEA, NSE e AFP è stata di 57.1±31.5, 5.6±2.7, 20.8±2.5, e 2,6±0,4 rispettivamente Nessuno deimarcatori era significativamente diverso dal range di normalità (Fig. 4).

L’induzione di EMT nelle focuscelle primarie da parte di TGF-β1

TGF-β1 quando incubato con le cellule tumorali polmonari a fuoco primario ha creato cambiamenti rilevanti per EMT, in molti casi. Pertanto, inquasi il 40% dei tumori dell’adenocarcinoma, le focuscelle primarie CK19-positive sono state indotte a perdere l’espressione di CK19 e a sottoporsi a EMT byTGF-β1. Questa percentuale di tumori era del 28% per SCC e del 50% per SCLC(Fig. 5). Pertanto, le focuscelle primarie SCLC sono inducibili a subire EMT da TGF-β1 più facilmente. Asmentioned sopra, le celle primarie di SCLC mostrano un più alto livello di EMT evenwithout induzione da TGF-β1 (TableI).

Un’altra serie di importanti marcatori di EMT è la perdita di E-caderina e il guadagno dell’espressione di vimentina. E-caderina è stata trovata peressere negativo in quasi il 37,5% delle cellule tumorali primarie di adenocarcinoma,il 52,3% delle cellule tumorali SCC e il 22% delle cellule tumorali SCLC (Fig. 6), prima del trattamento con TGF-β1. Bycontrast, l’espressione di vimentin in questi tumori è stata positiva nel 23,2% delle cellule tumorali dell’adenocarcinoma, nel 33,3% delle cellule tumorali SCC e nel 31,3% delle cellule tumorali SCLC (Fig. 7). Followingtreatment delle cellule primarie del fuoco del tumore del polmone con TGF-β1, l’espressione di lossof E-cadherin è stata associata sempre con un’espressione di invimentin di aumento (Fig. 8). La percentuale di tumori SCC che ha mostrato questa risposta a TGF-β1 (variazione del 40% nell’espressione di E-caderina e del 57% nell’espressione di vimentina) è più alta di quella per adenocarcinoma e SCLC (Fig. 6).

Discussione

Lo stato di espressione comparativa di CK19 nei tessuti del cancro primarylung e nelle effusioni pleuriche può essere utile per valutare la capacità metastasizzante di queste cellule tumorali. Pertanto, le cellule di versamento pleurico di patient un paziente hanno un livello più alto di negativoespressione di CK19 rispetto ai tessuti tumorali primari dello stesso paziente, si presume che l’espressione negativa di CK19 sia associata a invasione e metastasi (19). Pertanto, nel presente studio, una grande proporzione di pazienti con tumori SCLC aveva tessuto tumorale con noespressione di CK19 e le cellule di versamento pleurico in questi pazientiha mostrato una mancanza di espressione di CK19, indicando un alto grado dimetastasi in questo tipo di cancro del polmone, che è una caratteristica tipica di SCLC (20). Sono state suggerite diverse ragioni per la perdita dell’espressione di CK19, tra cui l’espressione alterata e la degradazione proteolitica potenziata(21).

Poiché CYFRA21-1 è un frammento di CK19, i livelli di versamento pleurico e siero CYFRA21-1 sono considerati importanti markersof malignità per molti tipi di cancro, in particolare per lungcancer (7,21). Tuttavia, è difficile essere certiregarding la diagnosi del cancro basata sui livelli circolanti di CYFRA21-1 asthere sono casi di cancro del polmone in cui ci sono diminuiti CYFRA21-1levels mentre c’è un aumento in altri casi (7,21).Tuttavia, dai risultati attuali, i livelli sierici di CYFRA21-1 sono diminuiti con l’aumentata possibilità di EMT, come rilevato dalla perdita dell’espressione di CK19 nei versamenti pleurici rispetto al tessuto tumorale primario corrispondente. Così, siero CYFRA21-1 levelsalong con CK19 stato di espressione delle cellule tumorali da primaryfocus e versamenti pleurici può identificare positivamente la capacità invasionand metastasi delle cellule tumorali del polmone. Altri markersincluding CA125, CEA, AFP e NSE, che sono comunemente usati per la diagnosi del cancro, non erano coerenti in questa valutazione.

La capacità metastatizzante è conferita alle cellule tumorali primarie tramite EMT e uno dei fattori primari che può indurre EMT è TGF-β1. Sebbene TGF-β1 funzioni normalmente come inibitore della proliferazione delle cellule epiteliali, a causa delle vie alterate di segnalazione in molte cellule tumorali, TGF-β1 agisce per migliorare la proliferazione delle cellule tumorali, comprese le cellule tumorali polmonari(22). Oltre a migliorare la crescita delle cellule tumorali, TGF-β1 è noto per promuovere l’EMT nelle cellule tumorali e quindi contribuire all’invasione e alla metastasi delle cellule tumorali. È stato suggerito che nelle prime fasi dello sviluppo tumorale primario nei tessuti epiteliali, TGF-β1 agisce come un inibitore della crescita tumorale attraverso l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi (23,24).Tuttavia, come progressione tumorale si verifica, durante le fasi successive oftumor sviluppo, c’è o inattivazione della via TGF-ß1signaling o regolazione aberrante del ciclo cellulare e thecancer cellule diventano resistenti alla inibizione della crescita da TGF-β1(23,24). In queste condizioni viene utilizzato TGF-β1come promotore di crescita da parte delle cellule tumorali (25). L’espressione di mRNA e proteine ofTGF-β1 era notevolmente elevata in molti tipi di cancro, tra cuiquelli del pancreas, del colon, dello stomaco, del polmone, dell’endometrio, della prostata,della mammella, del cervello e delle ossa (26).

Considerando che la propensione a sottoporsi a EMT è aumentata in presenza di una citochina come TGF-β1, che è nota per essere elevata nei pazienti affetti da cancro del polmone, abbiamo esaminato l’eliminabilità delle cellule focali primarie, ex vivo, da TGF-β1.A seconda del marcatore EMT impiegato, i tumori SCLC e SCC avevano una maggiore capacità di sottoporsi a EMT indotto da TGF-β1. SCLC focuscells primario sono inducibili a subire EMT da TGF-β1 più facilmente, se weconsider perdita di espressione CK19. C’è infatti, un più alto degreeof EMT, in termini di mancanza di CK19 in cellule tumorali primarie SCLC. Bycontrast, le cellule primarie del tumore di SCC rispondono dalla perdita di E-cadherinand ha elevato le espressioni di vimentin. Downregulation di E-cadherin, insieme con l’upregulation di N-cadherin caratterizza il processo di EMT e questi cambiamenti nell’espressione di queste proteine isassociated con l’acquisizione di resistenza ad apoptosis andanoikis (27,28).

In sintesi, i risultati del presente studio suggeriscono che l’invasione e la metastasi delle cellule tumorali polmonari possono essere valutate avendo un quadro completo del siero CYFRA21-1 insieme allo stato di espressione CK19 delle cellule focali primarie e dell’effusione pleurica. Questa valutazione può essere ulteriormente migliorata esaminando la propensità delle cellule focali primarie isolate a subire EMT indotta da GF-β1 in coltura cellulare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere l’assistenza tecnica del Dr Yong Chen e del Dr Jixin Jiang.

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