1.4.1 Mezzo di omogeneizzazione
La rottura cellulare viene solitamente eseguita in un mezzo leggermente ipo-osmotico o iso-osmotico per preservare l’integrità morfologica. Il saccarosio è comunemente usato come osmotico per prevenire organelli subcellulari o vescicole da gonfiore o restringimento avverso. Mannitolo e sorbitolo sono stati utilizzati anche quando il saccarosio è stato trovato per interferire con l’analisi biochimica della componente subcellulare. Il saccarosio è preferito alle soluzioni saline perché queste ultime tendono ad aggregare organelli subcellulari. I mezzi ipo-osmotici sono spesso utilizzati nell’isolamento delle frazioni di membrana plasmatica perché in queste condizioni, le cellule interrotte producono membrane plasmatiche sotto forma di grandi fantasmi o fogli. Ciò riduce significativamente l’elevato grado di variazione delle dimensioni di questi frammenti prima della centrifugazione. Sebbene il mezzo di omogeneizzazione sia solitamente di natura acquosa, i mezzi non acquosi come l’etere / cloroformio sono stati utilizzati per isolare gli organelli subcellulari. Tuttavia, i mezzi non acquosi possono inattivare alcuni enzimi e ridurre l’integrità morfologica di alcuni tessuti.
Agenti chelanti (EDTA o EGTA) possono essere aggiunti al mezzo di omogeneizzazione per rimuovere i cationi bivalenti, come Mg2+ o Ca2+ che sono richiesti dalle proteasi di membrana. È importante notare che gli inibitori della proteasi devono ancora essere inclusi nel mezzo perché i reagenti EDTA e tiolo possono attivare alcuni enzimi proteolitici. Tuttavia, molti enzimi dell’indicatore della membrana richiedono questi cationi per attività e possono essere inibiti dopo che i cationi sono stati rimossi dall’estratto. L’aggiunta di Mg2 + o Ca2 + al mezzo di omogeneizzazione mantiene l’integrità nucleare. Tuttavia, questi ioni possono causare l’aggregazione della membrana e diminuire il controllo respiratorio nei mitocondri.
La rottura cellulare del tessuto vegetale spesso rilascia fenoli che possono avere diversi effetti deleteri sugli enzimi vegetali. I composti fenolici vegetali comprendono essenzialmente due gruppi: i composti fenilpropanoidi (ad esempio tannini idrolizzabili) e i flavonoidi (ad esempio tannini condensati). I fenolici possono legame idrogeno con legami peptidici di proteine, o subire ossidazione da fenolo ossidasi a chinoni. I chinoni sono potenti agenti ossidanti che tendono anche a polimerizzare e condensare con gruppi reattivi di proteine per formare un pigmento scuro chiamato melanina che costituisce la base della doratura del tessuto vegetale. L’attaccamento della melanina alle proteine può inattivare molti enzimi. I gruppi idrossilici fenolici possono formare interazioni ioniche con gli amminoacidi basici delle proteine o interagire idrofobicamente con le regioni idrofobiche delle proteine. Pertanto, è importante rimuovere i composti fenolici il più rapidamente possibile e questo è meglio ottenuto utilizzando adsorbenti che si legano ai fenoli o ai chinoni o utilizzando agenti protettivi come borato, germanato, solfiti e mercaptobenzothiazolo che inibiscono l’attività fenolo ossidasi. Il fenolo adsorbente, polivinilpirrolidone in forma solubile in acqua o come prodotto insolubile altamente reticolato “Policlar” può essere aggiunto al mezzo di isolamento. Il polivinilpirrolidone lega quei composti fenolici che formano forti legami idrogeno con le proteine. L’albumina sierica bovina inoltre è stata riferita per reagire con i fenolici della pianta ed è inoltre un efficace scavenger del chinone.
Il frazionamento cellulare o tissutale viene eseguito invariabilmente a + 4°C per ridurre l’attività delle proteasi di membrana. Le proteasi possono essere suddivise in endopeptidasi ed esopeptidasi. Le endopeptidasi, che sono enzimi che fendono i legami peptidici interni, includono: proteasi acide che hanno un pH optima di pH 2,5–3,8 e possono essere inibite dall’inibitore dello stato di transizione pepstatina; proteasi della serina che possono essere inibite da diisopropilfluorofosfato e fenilmetilsulfonilfluoruro; e proteasi sulfidriliche che sono inibite da N-etilmaleimmide o E-64 (l-trans-epossisuccinil-leucilammide but butano). Esempi di esopeptidasi includono carbossipeptidasi che sono presenti nella maggior parte dei tessuti vegetali e facilmente idrolizzano la maggior parte degli amminoacidi C-terminali. Tutte le carbossipeptidasi vegetali studiate fino ad oggi sono inibite dal diisopropilfluorofosfato. Aminopeptidasi, dipeptidasi e tripeptidasi sono state identificate anche nelle piante. Altri composti utilizzati nei mezzi di omogeneizzazione includono agenti riducenti il disolfuro come il 2-mercaptoetanolo, il ditiotreitolo, il ditioeritritolo, il glutatione ridotto o la cisteina. Questo perché molti enzimi contengono un gruppo sulfidrilico del sito attivo essenziale che deve rimanere ridotto per mantenere l’attività enzimatica. Molti dei problemi di isolamento degli organelli sono associati alla rottura delle membrane fragili, ad esempio il tonoplasto che circonda il vacuolo. Oltre alla distruzione fisica di queste membrane, i tessuti vegetali contengono enzimi lipolitici attivi che possono attaccare direttamente i componenti lipidici delle membrane e disturbare gli organelli. Gli acidi grassi liberi rilasciati dall’azione idrolitica delle idrolasi aciliche possono inibire le attività atpasi dei mitocondri, del cloroplasto e della membrana plasmatica. Altri effetti deleteri degli acidi grassi sono anche ben stabiliti. Ci sono determinate circostanze che possono ridurre la ripartizione del lipido dalle lipasi e dalle idrolasi lipolitiche dell’acile in piante. Questi includono l’utilizzo di (1) un mezzo di isolamento con un pH di 7.5-8 a cui la maggior parte enzimi lipolitici e lipooxygenases esporre minimo di attività (2) agenti chelanti come l’EDTA, perché molti fosfolipasi sono Ca2+ dipendente; molti enzimi lipolitici, tuttavia, non vengono influenzati da agenti chelanti e (3) altri additivi come anti-ossidanti per evitare ossidativo composizione di acidi grassi idroperossidi, disolfuro di agenti riducenti, un enzima specifico inibitori e l’uso di acidi acido albumina di siero bovino che lega gli acidi grassi liberi. Ogni singolo mezzo di omogeneizzazione è diverso e può contenere inibitori specifici per enzimi come fosfolipasi o fosfatasi. Il glicerolo, ad esempio, viene spesso aggiunto al mezzo di isolamento per inibire la fosfatasi dell’acido fosfatidico. L’etanolammina e il cloruro di colina sono comunemente usati per inibire la fosfolipasi D.
La capacità tampone del mezzo di omogeneizzazione per il frazionamento delle cellule vegetali deve essere elevata per compensare il rilascio di acidi organici dal vacuolo interrotto che costituisce un volume sostanziale della cellula. Il mezzo di omogeneizzazione può essere formulato mediante valutazione empirica o analisi razionale. Ad esempio, per garantire che la proteina purificata pertinente rimanga intatta, tutti i principali inibitori delle proteasi possono essere aggiunti al mezzo di omogeneizzazione o in alternativa possono essere copiate soluzioni fisiologiche. Poiché il pH citoplasmatico della cellula vegetale è di circa 7,5-8,0, il mezzo di omogeneizzazione dovrebbe riflettere lo stato fisiologico della cellula ed è quindi debolmente tamponato al pH citoplasmatico.