industriale anaerobe Clostridium acetobutylicum utilizza polyketides per regolare la differenziazione cellulare

ceppi Batterici e media

C. acetobutylicum ATCC 824 è stata colta in un anaerobica camera (Coy Prodotti di Laboratorio) contenente un’atmosfera di 97% di azoto e idrogeno al 3%. 2xYTG medium67 conteneva 16 g/L di triptone, 10 g/L di estratto di lievito, 5 g/L di NaCl e 10 g / L di glucosio (se non diversamente specificato) con il pH regolato a 5.2 per i mezzi liquidi e 5,8 per i mezzi solidi (contenenti anche 15 g / L di agar). Clostridial mezzo di crescita (CGM)68 conteneva 30 g/L di glucosio (se non diversamente specificato), 6,25 g/L estratto di lievito, 2,5 g/L di solfato di ammonio, 1.25 g/L di NaCl, 2.5 g/L asparagina, 0.95 g/L potassium phosphate monobasic, 0.95 g/L dibasic potassio fosfato, 0,5 g/L di solfato di magnesio heptahydrate, 13 mg/L manganese sulfate heptahydrate, e 13 mg/L di ferro sulfate heptahydrate con pH regolato a 6.4. P2 medium69 conteneva 80 g / L di glucosio (se non diversamente specificato), 1 g/L di estratto di lievito, 2,2 g / L di acetato di ammonio, 0.5 g / L fosfato di potassio monobasico, 0,5 g / L solfato di potassio dibasico, 0,2 g/L solfato di magnesio eptaidrato, 1 mg/L acido para-aminobenzoico, 1 mg/L cloridrato di tiamina, 10 µg/L biotina, 10 mg/L solfato di manganese eptaidrato, 10 mg/L solfato ferroso eptaidrato e 10 mg / L NaCl con il pH regolato a 6,4. Clostridial basal medium (CBM)70 conteneva 10 g/L glucosio, 0,5 g/L fosfato monobasico di potassio, 0,5 g/L fosfato dibasico di potassio, 4 g/L triptone, 0.2 g / L solfato di magnesio eptaidrato, 10 mg/L solfato di manganese eptaidrato, 10 mg/L solfato ferroso eptaidrato, 1 mg / L acido para-amminobenzoico, 1 mg / L tiamina cloridrato e 2 µg/L biotina con il pH regolato a 6,9. Per le piastre CGM solide, è stato aggiunto 15 g / L agar. CBM-S (usato per le analisi liquide di sporulazione) era identico a CBM eccetto 50 g/L il glucosio è stato usato e 5 g/L CaCO3 è stato aggiunto appena prima dell’inoculazione delle colture. E. coli TOP10 (Thermo Fischer Scientific) è stato coltivato nel terreno di Luria-Bertani (LB) a 37 °C. Per i ceppi di clostridium appropriati, i terreni di coltura sono stati integrati con eritromicina (Ery; 40 µg/mL per i terreni solidi, 80 µg/mL per i terreni liquidi) e/o tiamfenicolo (Th; 5 µg/mL per i terreni solidi e liquidi). Kanamicina (Kan; 60 µg / mL) o cloramfenicolo (Cm; 25 µg/mL) sono stati aggiunti ai terreni di coltura di E. coli come indicato. I ceppi di clostridium ed E. coli sono stati mantenuti come scorte di glicerolo v/v al 20% conservate a -80 °C.

Costruzione plasmidica

oligonucleotidi sono stati forniti da Integrated DNA Technologies (Tabella supplementare 5). La polimerasi di Phusion (NEB) è stata utilizzata per tutte le reazioni di PCR. Per l’isolamento del DNA genomico da C. acetobutylicum ATCC 824, è stato utilizzato un metodo di lisi alcalina71. C. acetobutylicum è stato coltivato durante la notte in 2xYTG medio-fase stazionaria (OD600 > 2.0), a quel punto 10 mL di coltura sono stati centrifugati a 3500×g per 15 min (temperatura ambiente). Il surnatante è stato eliminato e il pellet cellulare è stato risospeso in un tampone SET da 5 ml (75 mm NaCl, 25 mM EDTA pH 8,0, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5). Il lisozima è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 2 mg / mL e la soluzione è stata delicatamente miscelata. La miscela è stata incubata a 37 °C per 60 min con una miscelazione delicata eseguita ogni 15 min. Dopo il periodo di incubazione, sono stati aggiunti 660 µL di tampone di lisi (1 M NaOH, 10% p/v SDS) e la soluzione è stata accuratamente miscelata. La proteinasi K è stata aggiunta ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL e la soluzione è stata incubata a 55 ° C per 1 h. Dopo questo periodo di incubazione, è stato aggiunto un volume uguale di fenolo:cloroformio (1:1) e la soluzione è stata miscelata per inversione per 5 min. La soluzione è stata quindi centrifugata a 3500×g per 15 min (temperatura ambiente) e la fase acquosa superiore è stata scartata mediante pipettaggio. Alla fase organica sono stati aggiunti 3 M di acetato di sodio (10% v/v in soluzione finale). Per precipitare il DNA genomico, sono stati aggiunti 2 volumi di etanolo e la soluzione è stata miscelata. Il DNA genomico precipitato è stato raccolto utilizzando un gancio di vetro e lavato con etanolo al 70%. Il DNA lavato è stato quindi essiccato su gas azoto per 15 min, risospeso in tampone TE basso (10 mm Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) e sciolto per incubazione a 50 °C.

Per la costruzione del plasmide pKO_mazF_mod (che in seguito sarebbe servito come modello per pKO_pks), i primer pKON_Fo e pKON_Ro sono stati utilizzati per amplificare una regione di 5,0 kb dal modello pko_mazf15. Questo passaggio è stato necessario per rimuovere una regione di 677 bp dal backbone pKO_mazF, che non siamo stati in grado di amplificare tramite PCR. Il prodotto PCR da 5,0 kb è stato purificato in gel, digerito alle estremità 5′ e 3 ‘ utilizzando PshAI, ligato per formare pKO_mazF_mod e trasformato in E. coli TOP10. I cloni trasformanti sono stati sottoposti a screening mediante digestione del test plasmidico purificato e il sequenziamento di Sanger è stato utilizzato per confermare la sequenza del clone finale di pKO_mazF_mod. Per la costruzione di plasmidi pKO_pks (per la cancellazione del gene pks da C. acetobutylicum), una regione di 3,8 kb contenente colE1, repL, bgaR e mazF è stata PCR amplificata da pKO_mazF_mod utilizzando primer pKO_F e pKO_R. Inoltre, i primer UHR_Fo e UHR_Ro e DHR_Fo e DHR_Ro sono stati utilizzati per amplificare le regioni di 1 kb DHR) che fiancheggia il gene pks (CA_C3355) da un C. acetobutylicum ATCC 824 modello di DNA genomico. Il gene di resistenza al cloramfenicolo / tiamfenicolo e il promotore costitutivo (P ptb da C. acetobutylicum) sono stati PCR amplificati da pKO_mazF_mod utilizzando primer CMR_F e CMR_R (regione 1.1 kb). Questi quattro prodotti PCR sono stati legati tramite Gibson assembly e trasformati in E. coli TOP10. I cloni trasformanti sono stati sottoposti a screening mediante digestione del test plasmidico purificato e il sequenziamento di Sanger è stato utilizzato per confermare la sequenza del clone finale di pKO_pks. Per la costruzione del plasmide pAN315 (necessario per la metilazione di pKO_pks e pCKO_pks prima della trasformazione in C. acetobutylicum), una regione di 6,4 kb dal plasmide pAN172 è stata amplificata utilizzando i primer pAN1_F e pAN1_R e una regione di 1,0 kb contenente il gene di resistenza alla kanamicina dal vettore pCOLA_Duet è stata amplificata utilizzando i primer KAN_Fo e KAN_Ro. I prodotti PCR estratti dal gel sono stati legati tramite Gibson assembly e trasformati in E. coli TOP10. I cloni trasformanti sono stati sottoposti a screening mediante digestione del test plasmidico purificato e il sequenziamento di Sanger è stato utilizzato per confermare la sequenza del clone pAN3 finale. Per la costruzione di plasmidi pCKO_pks (per l’espressione del gene pks sotto il promotore costitutivo della crotonasi da C. acetobutylicum), primer CPKS_Fo e CPKS_Ro sono stati utilizzati per PCR amplificare il gene 5.4 kb C. acetobutylicum ATCC 824 pks (CA_C3355) con sporgenze appropriate per l’assemblaggio Gibson. Il backbone pWIS_empty vector71 (contenente il promotore crt costitutivo a monte del sito di clonazione multipla) è stato PCR amplificato utilizzando primer pWIS_F e pWIS_R ottenendo un prodotto di 5,0 kb. I due prodotti PCR purificati in gel sono stati legati tramite Gibson assembly e trasformati in E. coli TOP10. I cloni trasformanti sono stati sottoposti a screening mediante digestione del test plasmidico purificato e il sequenziamento Sanger è stato utilizzato per confermare la sequenza del clone pCKO_pks finale.

Per la costruzione del plasmide pET24b_pks, il gene C. acetobutylicum ATCC 824 pks da 5,4 kb (CA_C3355) è stato amplificato dal DNA genomico di C. acetobutylicum utilizzando primer PKS_Fo e PKS_Ro. Il vettore PET24B doppiamente digerito (ECORI / Xhoi digerito) è stato legato con un prodotto pks PCR doppiamente digerito (EcoRI/XhoI digerito) e il prodotto di legatura è stato trasformato in E. coli TOP10. I cloni trasformanti sono stati sottoposti a screening mediante digestione del test plasmidico purificato e il sequenziamento Sanger è stato utilizzato per confermare la sequenza del clone finale pET24b_pks.

Elettro-trasformazione di C. acetobutylicum

Prima della trasformazione in C. acetobutylicum, vector pKO_pks è stato co-trasformato con pAN3 in E. coli TOP10 tramite elettroporazione. Questa procedura ha permesso la metilazione di pKO_pks necessaria per superare il sistema di modifica della restrizione nativo attivo in C. acetobutylicum 72. Purificazione plasmidica di E. coli pKO_pks/pAN3 è stata eseguita la coltura liquida e la miscela plasmidica risultante è stata utilizzata per elettroporazione di C. acetobutylicum usando il metodo precedentemente pubblicato72 che descriviamo qui. Per preparare le cellule elettrocompetenti, una singola colonia di C. acetobutylicum da una piastra 2xYTG (più di 1 settimana) è stata colpita dal calore a 80 °C per 10 min e utilizzata per inoculare 10 mL di CGM. Dopo aver incubato durante la notte a 37 °C e raggiunto la fase metà esponenziale (OD600 0,4–0,9), è stata utilizzata una coltura da 6 ml per inoculare 54 ml di 2xYTG fresco. Questa sottocultura è stata incubata a 37 °C fino a raggiungere OD600 1.2 (~5 h), a quel punto la sottocultura è stata centrifugata a 3500×g per 20 min (4 °C). Dopo la rimozione del surnatante, il pellet cellulare è stato risospeso in 20 ml di tampone di elettroporazione ghiacciato (EPB; 270 mM di saccarosio, 5 mM di NaH2PO4, pH 7.4). Le cellule risospese sono state centrifugate a 3500×g per 10 min (4 °C), il surnatante è stato scartato e il pellet cellulare è stato risospeso in 20 ml di EPB ghiacciato. Dopo una pellettatura finale mediante centrifugazione a 3500×g per 10 min (4 °C), il surnatante è stato scartato e il pellet è stato risospeso in 2,3 mL di EPB ghiacciato. Questa risospensione finale è stata utilizzata come scorta di celle elettrocompetenti. Le elettro-trasformazioni sono state eseguite miscelando (su ghiaccio) 500 µL di cellule competenti e ~20 µL di soluzione di DNA plasmidico (1-5 µg totali) da trasformare. La miscela è stata trasferita in una cuvetta di elettroporazione da 0,4 cm e lasciata incubare sul ghiaccio per 15 min. Le elettroporazioni sono state eseguite con i seguenti parametri: tensione, 2000 V; capacità, 25 µF; resistenza, Ω infinito. Dopo elettroporazione, i campioni sono stati risospesi in 1 ml 2xYTG e trasferiti in una provetta contenente 9 ml 2xYTG. Dopo la miscelazione per inversione, le colture sono state lasciate recuperare a 37 °C per 4 h. Le colture di recupero sono state centrifugate a 3500×g per 15 min (temperatura ambiente) e il surnatante è stato scartato. Il pellet cellulare è stato risospeso in 500 µL 2xYTG e 100 µL sono stati placcati su piastre solide 2xYTG integrate con l’antibiotico appropriato. La piastra è stata incubata a 37 °C per 2-3 giorni e le colonie trasformanti sono state sottoposte a verifica basata sulla PCR.

Delezione del gene pks e complementazione genetica

KO mirato del gene pks (ca_c3355) in C. acetobutylicum ATCC 824 è stato ottenuto utilizzando il metodo precedentemente pubblicato15. In dettaglio, 5 µg di miscela plasmidica pKO_pks/pAN3 metilata sono stati trasformati in C. acetobutylicum utilizzando il metodo sopra descritto. Dopo il recupero in mezzo liquido 2xYTG per 4 h, i pellet cellulari sono stati raccolti per centrifugazione (3500×g, 15 min, temperatura ambiente), risospesi in 0,5 mL di liquido fresco 2xYTG e 100 µL della coltura cellulare risospesa sono stati placcati su piastre solide 2xytg + 5 µg/mL Th + 40 mm β-lattosio. In queste condizioni di placcatura, solo le cellule che hanno subito l’evento di ricombinazione omologa a doppio crossover desiderato dovrebbero sopravvivere. La controselezione della spina dorsale vettoriale è fornita dal promotore inducibile al lattosio (P bgaL ), che guida il gene della tossina mazF sulla spina dorsale vettoriale pKO_pks. A seguito di questa procedura di placcatura, sono state osservate circa 10 colonie sulle piastre β-lattosio 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 mM. Di queste colonie 10, quattro sono state due volte ristrette e sottoposte alla verifica della PCR delle colonie. Quattro serie di primer sono stati utilizzati come base per la verifica PCR colonia, come dettagliato in Fig supplementare. 2.

Per generare il ceppo di complementazione genetica pks , è stata eseguita l’elettroporazione di ∆pks C. acetobutylicum con una miscela di plasmidi pCKO_pks/pAN3 come descritto sopra. Dopo elettroporazione e recupero, le colture sono state placcate su supporti solidi 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL Ery. Dopo due riprese su supporti solidi 2xYTG + 5 µg/mL Th + 40 µg/mL Ery, le potenziali colonie che ospitano pCKO_pks sono state sottoposte a screening tramite colony PCR utilizzando primer pCKO_F e pCKO_R.

LC-HRMS analisi metabolomica

Per confronti metabolomici non mirati di wild-type e ∆pks C. acetobutylicum, singole colonie di ciascun ceppo sono state colpite dal calore a 80 °C per 10 min e utilizzate per inoculare 10 mL di CGM liquido (30 g/L di glucosio). Dopo l’incubazione notturna (stagnante) fino a raggiungere OD600 ~1.0, queste colture sono state utilizzate per inoculare 10 ml di CGM liquido (80 g/L di glucosio) con un inoculo al 10% per la sottocultura. Dopo ~5 h (OD600 ~1.0) di crescita stagnante, le sottoculture sono state utilizzate per inoculare fermentazioni di matraccio quadruplicato (70 mL CGM, 80 g/L glucosio + 5 µL Antischiuma 204, 3% inoculo) agitate tramite barre magnetiche. Carbonato di calcio (6 g / L) è stato integrato al mezzo di fermentazione per tamponare il pH. Tutte le colture sono state eseguite a 37 °C. Circa 5 µg / mL Th è stato incluso in tutte le colture di ∆pks ad eccezione della coltura di fermentazione finale, poiché alcuni antibiotici sono noti per perturbare le fasi di fermentazione ABE. Campioni di brodo di fermentazione (1 ml) da ciascuna replica sono stati prelevati durante la fase stazionaria iniziale ed estratti con 3 ml di metanolo cloroformio 2:1. Le miscele sono state vortexate, separate tramite centrifugazione (2700×g, 10 min) e lo strato inferiore ricco di cloroformio è stato trasferito in una fiala di vetro. Questi estratti organici sono stati essiccati con gas azoto, risospesi in 100 µL di metanolo e 10 µL sono stati iniettati su uno strumento QTOF LC-MS di massa accurata Agilent Technologies 6520 dotato di una colonna Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). È stato utilizzato un gradiente lineare di 2-98% CH3CN (vol/vol) su 40 min in H2O con acido formico allo 0,1% (vol/vol) ad una portata di 0,5 mL/min. La piattaforma di analisi metabolomica XCMS16 (Scripps Research Institute) è stata utilizzata per confrontare i metabolomi dei ceppi wild-type e ∆pks sulla base dei dati quadruplicati LC-HRMS. Picchi MS unici per p pks (Fig. 1a) sono stati identificati utilizzando i seguenti parametri: p-value < 0.01, fold change > 10.0, peak intensity > 5000.

Fermentazioni a bioreattore

Per confrontare i profili di fermentazione ABE di wild-type e ∆pks C. acetobutylicum, bioreattore fermentazioni sono state effettuate in bioreattori DASGIP (4 × GPI 100 vasi, sistema DASGIP Bioblock) con 500 ml volumi di lavoro. Colture notturne (10 mL CGM, 30 g / L glucosio, stagnante, 34 °C) inoculate con colonie individuali di C. acetobutylicum scioccate dal calore sono state coltivate fino a raggiungere OD600 ~1. Un inoculo del 10% è stato quindi utilizzato per avviare una sottocultura (30 ml di media P2, 80 g/L di glucosio, stagnante, 34 °C) e la sottocultura è stata incubata fino a raggiungere OD600 ~1. Le sottoculture da 30 ml sono state quindi trasferite asetticamente in bioreattori DASGIP individuali pre-caricati con un mezzo P2 da 500 ml (80 g/L di glucosio, 100 µL di antischiuma 204, 34 °C). Le fermentazioni sono state autorizzate a procedere per 54 h con campionamento periodico per misure di densità ottica, analisi del prodotto di fermentazione e quantificazione dei composti 1, 2 e 3. La temperatura è stata mantenuta a 34 °C durante tutta la fermentazione, l’agitazione è stata fornita mescolando a 200 rpm e il pH è stato mantenuto sopra 5.0 tramite aggiunta automatica di 3 M NH4OH. Per mantenere le condizioni anaerobiche, il gas azoto privo di ossigeno è stato sparso ad una velocità di 2 sL/h per tutta la durata della fermentazione. Per la quantificazione dei composti 1, 2 e 3, 1 ml di brodo di fermentazione è stato miscelato con 3 ml di acetato di etile, vortexato, separato tramite centrifugazione (2700×g, 10 min, temperatura ambiente) e lo strato organico superiore isolato. Lo strato organico è stato essiccato per evaporazione rotativa, risospeso in 200 µL di metanolo e 20 µL è stato iniettato su uno strumento LC-MS quadrupolo Agilent Technologies 6120 (con DAD) dotato di una colonna Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). È stato utilizzato un gradiente lineare di 2-98% CH3CN (vol/vol) su 40 min in H2O con acido formico allo 0,1% (vol/vol) ad una portata di 0,5 mL/min. I composti 1, 2 e 3 sono stati identificati mediante assorbimento UV (240 nm) come dimostrato in Fig. 1b, e sono stati quantificati dall’area di picco integrata (assorbanza a 240 nm).

Procedure analitiche di fermentazione

Uno spettrofotometro è stato utilizzato per determinare la densità cellulare misurando la densità ottica a 600 nm (OD600). Un sistema UFLC Shimadzu Prominence dotato di una colonna Biorad Aminex HPX-87H (300 mm × 7,8 mm) è stato utilizzato per analizzare C. acetobutylicum brodo di fermentazione per la concentrazione di glucosio e prodotti di fermentazione (acetato, butirrato, lattato, acetone, butanolo ed etanolo). Campioni di brodo di fermentazione (1 mL) sono stati prima pellettati mediante centrifugazione a 10.000×g per 3 min, seguita dalla filtrazione del surnatante utilizzando un filtro a siringa PVDF da 0,22 micron. Campioni di surnatante filtrato (20 µL) sono stati iniettati sul sistema UFLC con fase mobile di acido solforico 0,01 N che scorre a 0,7 mL/min, temperatura della colonna di 35 °C e sono stati cromatografati per 35 min. Gli analiti sono stati rilevati mediante l’uso di un rilevatore di indice di rifrazione (utilizzato per quantificare le concentrazioni di glucosio, acetato, lattato, butanolo ed etanolo) e di un rilevatore di array di diodi (utilizzato per quantificare le concentrazioni di butirrato (208 nm) e acetone (265 nm)).

RNA isolation and RNA-Seq analysis

Campioni (10 mL) di brodo di fermentazione sono stati prelevati in triplice copia biologica da fermentazioni a bioreattore di wild-type e ∆pks C. acetobutylicum 26 h post inoculazione. I campioni sono stati centrifugati (4000×g, 10 min, 4 °C) e i pellet sono stati risospesi e conservati nel reagente cellulare RNAprotect (Qiagen). L’RNA totale è stato estratto utilizzando un Mini kit RNeasy (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. Un trattamento con DNasi su colonna è stato eseguito utilizzando DNasi I (priva di RNasi) (NEB). Il controllo di qualità dell’RNA, la costruzione della biblioteca e il sequenziamento della biblioteca sono stati eseguiti dal laboratorio di genomica funzionale QB3 dell’Università della California-Berkeley e dal laboratorio di sequenziamento genomico Vincent J. Coates. La qualità e la concentrazione dell’RNA sono state valutate utilizzando un nanochip su un bioanalizzatore Agilent 2100. I batteri 16S e 23S rRNA sono stati rimossi utilizzando un kit RiboZero (Illumina). L’RNA messaggero risultante (mRNA) è stato convertito in una libreria RNA-Seq utilizzando un kit di costruzione della libreria mRNA-Seq (Illumina). Il sequenziamento della libreria di RNA è stato eseguito su un Illumina HiSeq4000 con 50 bp single end reads. Le letture di sequenziamento (50 bp) sono state elaborate e mappate sul genoma C. acetobutylicum ATCC 824 (NCBI accession NC_003030.1 e NC_001988.2 ) utilizzando CLC Genomics Workbench 9.0 con parametri predefiniti. Letture che non si allineano in modo univoco al genoma sono stati scartati. Le differenze nell’espressione genica tra wild-type e ∆pks C. acetobutylicum sono state calcolate utilizzando lo stesso software. I geni sono stati considerati espressi in modo differenziale con p-value < 0.003 (basato su un test t spaiato, n = 3) e |cambiamento di piega normalizzato |> 2.0. Le correzioni false del tasso di scoperta ai valori p sono state calcolate in CLC Genomics Workbench 9.0 utilizzando un metodo pubblicato73. I risultati dell’analisi RNA-Seq sono presentati in Dati supplementari 1. L’analisi delle stringe30 è stata eseguita per determinare le presunte interazioni proteina-proteina tra i geni espressi in modo differenziale rivelati dall’analisi RNA-Seq.

Test di confronto fenotipo

I test di sporulazione liquida sono stati eseguiti con modifiche minori74. I campioni sono stati prelevati da colture biologiche di triplicato liquido dopo 5 giorni di incubazione (30 mL CBM-S, 37 °C). I campioni 20 µL sono stati sottoposti a shock termico (80 °C, 10 min), le diluizioni (101-106) sono state individuate su piastre 2xYTG e le colonie sono state enumerate dopo 30 h di incubazione (37 °C) per calcolare il numero di unità formanti colonie resistenti al calore (cfu/mL). Per la complementazione chimica di ∆pks nel saggio di sporulazione liquida, il clostrienosio purificato (concentrazione finale 3,5 µM) è stato integrato nelle colture CBM-S di ∆pks C. acetobutylicum al momento dell’inoculazione. Poiché il composto 3 è stato aggiunto come soluzione concentrata in metanolo, il volume equivalente di metanolo (60 µL) è stato aggiunto a tutte le altre colture di dosaggio di sporulazione liquida (wild-type e non-completed p pks) per controllare questo effetto.

Per i saggi di sporulazione solida, è stato impiegato un metodo precedentemente descritto75 con alcune modifiche. In dettaglio, le singole colonie di shock termico (80 °C, 10 min) sono state coltivate in mezzi liquidi (10 mL CGM, 37 °C) per 24 h. Le colture sono state diluite di un fattore 106 e placcate su CBM solido. Il campionamento è stato condotto 1, 2, 3, 4 e 6 giorni dopo la placcatura iniziale. Per il campionamento, tre singole colonie sono state combinate e completamente risospese in 60 µL di CGM liquido. 20 µL della miscela di colonie risospese sono stati quindi sottoposti a shock termico (80 °C, 10 min), le diluizioni (101-106) sono state individuate su piastre 2xYTG e le colonie sono state enumerate dopo 30 h di incubazione (37 °C) per calcolare il numero di unità di formazione di colonie resistenti al calore (cfu/colonia). Tutti i campioni sono stati eseguiti come triplicati biologici.

I test di accumulo del granulosio sono stati eseguiti mediante colorazione di iodo53. Le colture liquide di fase mid-log (OD600 ~0.6) (P2, 37 °C) sono state placcate su terreno solido 2xYTG con livelli elevati di glucosio (50 g/L) per consentire la produzione di granulosio. Le piastre sono state incubate a 30 °C per 4 giorni, a quel punto sono state macchiate dall’esposizione a un letto di cristalli di iodio per 10 min. Le piastre sono state poi lasciate riposare per 10 minuti prima dell’imaging. Per la complementazione chimica di ∆pks nel test di accumulo della granulosa, il clostrienosio purificato (concentrazione finale della piastra 4.0 µM) è stato incorporato in piastre solide 2xYTG prima della placcatura della coltura di ∆pks. Poiché il clostrienosio è stato aggiunto alle piastre 2xYTG come soluzione concentrata in metanolo (miscelato nel mezzo fuso prima della solidificazione), il volume equivalente di metanolo (6 µL) è stato aggiunto a tutte le altre piastre 2xYTG utilizzate nei test di accumulo della granulosa per controllare questo effetto.

Singole colonie di C. acetobutylicum coltivate su piastre CBM per 48 h (37 °C) sono state osservate e riprese utilizzando un microscopio da dissezione Leica MZ16 F dotato di una fotocamera Leica DFC300 FX.

I saggi di diffusione dell’olio sono stati eseguiti come precedentemente descritto76, 77, 78. In dettaglio, un bicchiere di vetro da 400 ml (diametro interno di 7,5 cm) è stato riempito con 300 ml di acqua e una goccia di 10 µL di olio per lampade di paraffina è stata aggiunta e lasciata spargere in un film sottile sulla superficie dell’acqua per un periodo di 5 min (~25 mm di diametro). Sono state preparate soluzioni di surfactina, clostrienosio purificato e un tampone di controllo del fosfato di potassio al pH e alla concentrazione indicati (preparato in tampone di fosfato di potassio da 10 mm). Circa 10 µL di campione sono stati accuratamente aggiunti al centro del film d’olio e l’effetto sul film d’olio è stato osservato. Si prevede che i campioni con attività tensioattiva formino zone di compensazione circolari stabili nel film d’olio, con attività tensioattiva più potente corrispondente a zone di compensazione più ampie (o dispersione completa del film d’olio per attività tensioattiva molto elevata). Sono stati eseguiti test di collasso a goccia77, 79, 80. Microwell circolari (diametro interno 8 mm) all’interno del coperchio in polistirene di una piastra da 96 microwell (12,7 × 8,5 cm) sono stati rivestiti con un sottile strato di olio per lampade di paraffina aggiungendo 2,0 µL di olio per lampade di paraffina a ciascun pozzetto e consentendo alla goccia di diffondersi uniformemente sul microwell per un periodo di 1 h. Sono stati preparati campioni di surfactina, clostrienosio purificato e controllo del fosfato di potassio come per i saggi di diffusione dell’olio. Circa 5 µL di campione sono stati accuratamente aggiunti al centro del microwell. Dopo 5 min, è stata osservata la forma e il grado di diffusione della goccia. Mentre si prevede che i controlli tampone formino perle stabili sulla superficie del microwell, si prevede che i campioni contenenti tensioattivo collassino e si diffondano sulla superficie del microwell, con un’attività tensioattiva più potente corrispondente a un grado più elevato di diffusione delle gocce.

Purificazione e analisi in vitro della proteina PKS

Per purificare la proteina PKS con tag His6 per l’analisi in vitro, pET24b_pks è stato trasformato in E. coli BAP1. Una singola colonia è stata inoculata in 10 mL LB + 50 µg/mL kanamicina (Kan) per la crescita notturna a 37 °C. Circa 7 mL di coltura notturna sono stati utilizzati per inoculare 700 mL LB + 50 µg/mL Kan, e la coltura è stata agitata a 240 rpm e 37 °C fino a raggiungere OD600 di 0,5. Dopo la glassa della coltura per 10 min, il tio-β-d-galattoside dell’isopropile (IPTG) è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 0.1 mm per indurre l’espressione proteica e la coltura è stata incubata a 16 °C per 16 h. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione (5500×g, 4 ° C, 20 min), risospese in tampone di lisi da 25 ml (25 mm HEPES, pH 8,0, 0,5 M NaCl, 5 mm imidazolo) e lisate mediante omogeneizzazione su ghiaccio. I detriti cellulari sono stati rimossi mediante centrifugazione (17.700×g, 4 °C, 60 min) e la resina di agarosio Ni-NTA è stata aggiunta al surnatante (coltura da 2 mL/L). La miscela è stata nutata a 4 ° C per 1 h, caricata su una colonna di flusso gravitazionale e la proteina PKS è stata eluita con concentrazioni crescenti di imidazolo nel tampone A (20 mm HEPES, pH 8,0, 1 mM DTT). La proteina PKS purificata è stata concentrata e il tampone è stato scambiato in Tampone A + 10% di glicerolo utilizzando un concentratore centrifugo Vivaspin. Aliquote di proteina PKS purificata sono state aliquote e flash congelate in azoto liquido. La resa proteica approssimativa era di 5 mg / L (203 kDa).

Un test di carico PKS con substrato marcato con 14C contenuto, in un volume totale di 15 µL, 4 mm ATP, 2 mm MgCl2, 1 mM TCEP, 0.5 mm CoA, acido 2-14C-malonico (0,1 µCi), 10 µM MatB, 17 µM PKS e 50 mm HEPES, pH 8,0. Dopo 2 ore di incubazione a 25 °C, i campioni sono stati spenti aggiungendo un volume uguale di tampone campione 1× SDS. Dopo l’analisi di SDS–PAGE con un gel TGX 4-15% (Criterio), il gel è stato essiccato per 2 h a 50 °C ed esposto su uno schermo di fosforo di stoccaggio (20 × 25 cm; Dinamica molecolare) per 5 giorni. La proteina radiomarcata è stata ripresa su un Typhoon 9400 phosphorimager (modalità fosforo di stoccaggio, risoluzione 50 µm; Amersham Biosciences).

Per i test in vitro del prodotto (50 µL) della proteina PKS, 8 µM di PKS sono stati incubati con malonil-CoA (2 mM) in tampone fosfato (100 mM, pH 7.0) a temperatura ambiente per 2 h per generare il composto 4, identificato mediante confronto con uno standard chimico. NADPH (2 mm) è stato aggiunto al test per generare composti 5 e 6, entrambi identificati rispetto agli standard chimici. Dopo l’incubazione, le miscele di dosaggio sono state estratte due volte con 100 µL di acetato di etile al 99%/acido acetico all ‘ 1% (v / v). Gli estratti organici sono stati essiccati e risospesi in 100 µL di metanolo e 10 µL sono stati iniettati su uno strumento LC-MS quadrupolo Agilent Technologies 6120 (con DAD) dotato di una colonna Agilent Eclipse Plus C18 (4,6 × 100 mm). È stato utilizzato un gradiente lineare di 2-98% CH3CN (vol/vol) su 40 min in H2O con acido formico allo 0,1% (vol/vol) ad una portata di 0,5 mL/min. L’analisi LC-HRMS degli estratti di analisi è stata eseguita su uno strumento LC-MS QTOF a massa accurata Agilent Technologies 6520 dotato di colonna Agilent Eclipse Plus C18 (4.6 × 100 mm) utilizzando lo stesso gradiente di solvente e la stessa portata sopra descritta.

Disponibilità dei dati

RNA-seq i dati generati in questo studio sono stati depositati in ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) con il numero di adesione E-MTAB-6019. Tutti gli altri dati rilevanti sono disponibili presso gli autori su richiesta.