Il ruolo dei segnali chordin/Bmp nello sviluppo faringeo dei mammiferi e nella sindrome di DiGeorge/ Sviluppo

RISULTATI

Difetti di gastrulazione nei topi Chrd – / –

La proteina legante Bmp secreta da Chrd è espressa nel nodo del topo ei suoi derivati, notocord e endoderma faringeo(Fig. 1 BIS-F). La proteina Chrd contiene quattro domini ricchi di cisteina (CR), tutti in grado di legare Bmps.CR1 e CR3 mostrano la più alta affinità per Bmp4 e possono antagonizzare i segnali Bmp sull’iniezione di mRNA negli embrioni di Xenopus(Larrain et al., 2000). Per generare un allele nullo di Chrd, abbiamo preparato un costrutto di targeting con codoni di stop di traduzione nei tre possibili frame di lettura all’interno della regione peptidica del segnale. I codoni di stop sono stati seguiti da un frameshift e dall’inserimento, dopo CR1, di cassette IRES-lacZ e PGK-neo che hanno ulteriormente distrutto il gene Chrd (Fig.1G). Le trascrizioni di questo allele Chrdtm1DR (di seguito denominato Chrd-) erano embrioni inChrd-/- non rilevabili allo stadio del nodo(Fig. 1J, punta di freccia).

I topi eterozigoti Chrd erano vitali e fertili e sono stati accoppiati per generare embrioni Chrd-/- di vario sviluppo stages.At giorno E8. 5, abbiamo osservato la presenza di noduli di riassorbimento nell’utero didonne in gravidanza e una piccola riduzione del numero previsto DICRD-/- embrioni (50 recuperati, 57 attesi). Gli embrioni mutanti omozigoti quattrogenotipati hanno mostrato una chiara riduzione delle dimensioni della regione embrionale, accompagnata da un allargamento dell’allantois rispetto al resto dell’embrione (Fig.2 BIS, A”). Nelle sezioni istologiche, una notevole ipoplasia della piastra neurale (Fig.2B, B’), assenza di somiti e notocorda (Fig. 2C, C’), e un’abbondanza di cellule mesodermiche extra-embrionali nell’allantois(Fig. 2D, D’) sono stati osservati. Il resto dei mutanti (46) era morfologicamente indistinguibile dai loro compagni eterozigoti e wild-type. Il fenotipo dei quattro mutanti normali era simile, ma meno pronunciato, alla ventralizzazione del mesoderma osservata nel doppio Chrd omozigote; Nogmutanti (Bachiller et al., 2000) in cui, inoltre, erano presenti anche troncazioni anteriori del neuralplate.

In zebrafish e Xenopus, l’inattivazione del Chrd provoca un’espansione del mesoderma ventrale e una riduzione del mesoderma dorsale e della piastra neurale (Schulte-Merker et al.,1997). Nei mammiferi, il mesoderma si forma durante la gastrulazione mediante l’inibizione delle cellule dell’epiblasto attraverso la striscia primitiva. Le cellule che escono all’estremità posteriore della striscia primitiva si spostano nella regione extra-embrionale dove danno origine a un lignaggio mesodermico (allantois, amnion e bloodislands del sacco vitellino) equivalente al mesoderma ventrale diXenopus. Al contrario, le cellule situate in più regioni anteriori delstreak rimangono all’interno dell’embrione propriamente detto e producono il mesoderma parassiale, intermedio e laterale del tronco futuro. Il fenotipo precoce dei mutanti CHRD -/ -, in cui l’allantois è espanso alla spesa del mesoderma embrionale, è coerente con una ventralizzazione precoce dell’embrione di topo. Questo fenotipo deve portare alla morte degli animali affetti, in quanto nessun mutante omozigote con allantois anormale è stato recuperato dalle disezioni negli stadi successivi. Analisi di questo fenotipo con marcatori molecolarinon è stato effettuato perché sono stati ottenuti così pochi embrioni anormali.

Mortalità perinatale

Solo il 49% (95 su 194) degli animali Chrd-/-attesi è stato recuperato alla nascita, mostrando tutti lo stesso penetrantfenotipo. Di questi, la maggior parte era nata morta,ma alcuni tentarono, senza successo, di gonfiare i polmoni. Esternamente, i neonati mutanti omozigoti erano leggermente più piccoli dei loro compagni di letteratura wild-type e mostravano cianosi, microcefalia e riduzione dell’orecchio esterno, che era fissato anormalmente vicino all’occhio (Fig. 3 BIS”).Esame istologico (Fig.3B ‘- C’) ha rivelato la mancanza di timo (t, un derivato della terza sacca faringea) e palato secondario (p), e ipoplasia dell’orecchio interno (ie) nei mutanti. Il lobo anteriore e la pars intermedia della ghiandola pituitaria (pi), entrambi derivati dall’ectoderma orale dorsale immediatamente adiacente al bordo cefalico dell’endoderma anteriore, erano normali(Fig. 3C, C’). Questo ha definito il limite rostrale del fenotipo nell’orofaringe, conmalformazioni limitate ai derivati dell’endoderma che esprime il Chrd. La ghiandola tiroidea, che si forma nell’endoderma faringeo ventrale al cieco del forame, si differenziava ma era ipoplastica e di forma irregolare(th, Fig. 3 QUATER”). Le ghiandole paratiroidi, derivati delle sacche faringee 3 e 4, erano assenti(dati non mostrati), un’osservazione coerente con l’ipocalcemia neonatale osservata in individui con sindrome di DiGeorge (DiGeorge, 1968). Concludiamo che il fenotipo di Chrd – / – stillborn mice ricapitola la maggior parte delle caratteristiche descritte in tali individui.

Difetti scheletrici

Nei preparati scheletrici di animali appena nati, le ossa appendicolari e lombari erano normali, ma la base del cranio elo scheletro assiale anteriore presentava molteplici difetti. Le alterazioni dell’osso temporale comprendevano la mancanza della squama temporalis (st) e l’accorciamento dell’arcata zigomatica (Fig.4 BIS, A”). Abbiamo anche osservato una notevole ipoplasia dell’osso ioide e delle cartilagini tiroidee e cricoidi laringee(Fig. 4B’) e mascella anabnormalmente piccola (Fig.4 QUATER”). Nella base del cranio, l’alisfenoide (as)appariva normale, ma nella linea mediana le ossa basioccipitali(bo) e basisfenoidi (bs) erano fuse e il presfenoide(ps) era ipoplastico (Fig. 4D,D’). Consistentwith i risultati istologici, le mensole palatine non sono riuscito ad estendersi mediallyto formano il palato secondario. Nell’orecchio, l’anello timpanico e la capsula oticasono stati ridotti e malformati (Fig.4D’). Malformazioni scheletriche sono state osservate anche nel cervicalee regioni toraciche della colonna vertebrale. I corpi vertebrali (vb) eranopiù piccoli nei neonati (Fig. 4E’), con ritardoossificazione e perdita occasionale di altri elementi delle vertebre come processi spinosi, archi neurali e l’arco anteriore dell’atlante(Fig. 4E ‘ Efig. 5 BIS”).

I difetti scheletrici dei mutanti Chrd erano già rilevabili incondensazioni del artilago a E14.5 (Fig.5 BIS, A”). Le cartilagini basioccipitale e basisfenoide erano fuse, e il centro di ossificazione del basioccipitale era più stretto ed esteso nel basisfenoide (Fig.5 TER, B’). La notocorda anteriore, che era presente nelmidline del basioccipitale di tipo selvaggio, era assente nei mutanti Chrd(Fig. 5 TER, B’). L’assenza della notocorda anteriore è stata confermata dall’esame istologico della regione cervicale a E14.5 (Fig.5F”).

Le ossa colpite dalla mutazione Chrd sono molto diverseorigine. Il basioccipitale è puramente di origine somitica; parti delbasisfenoide derivano dall’ossificazione endocondrale del mesenchima cefalico; ilpalatina proviene dall’ossificazione intramembranosa del mesenchima derivato dalla cresta neurale; le capsule otiche si differenziano da un mix di cellule mesodermiche parassiali della cresta neurale; e lo ioide è strettamente derivato dalla cresta neurale(Le Douarin e Kalcheim,1999). In mezzo a tale diversità di lignaggi, il principio unificante del fenotipo sembra essere la posizione di strutture malformate nella prossimità del mesendoderma assiale che esprime il Chrd (Fig. 1E). Questa interpretazione è coerente con la degenerazione prematura osservata del anteriornotocordo negli animali Chrd – / – e con il requisito di segnali derivati dalla placca precordale e dal mesendoderma per lo sviluppo dello scheletro della testa (Belo et al., 1998; Couly et al., 2002; David et al.,2002).

Difetti cardiovascolari simili a DiGeorge

La cianosi osservata alla nascita può essere un segno di malfunzionamento cardiaco. Per indagare ulteriormente, sono state eseguite dissezioni in diversi stadi dello sviluppo embrionale. Alla E14.5, i cuori diChrd – / – animali hanno mostrato una singola nave, invece di thenormal due, nel tratto di deflusso cardiaco(Fig. 5D, D’, E, E’).Questa condizione è nota negli esseri umani come persistente tronco arterioso ed è una malformazione importante negli individui con sindrome di DiGeorge. La mancanza di separazione tra l’aorta ascendente e il tronco polmonare può aumentare il carico di lavoro del ventricolo destro causandone l’ipertrofia, nonché la vasodilatazione, l’edema e l’emorragia osservati negli embrioni E14. 5(Fig. 5 QUATER”). Come sindrome di inDiGeorge, i difetti nel sistema cardiovascolare si estendevano oltre iltratto di flusso e comprendeva i grandi vasi derivati dagli archarteries faringei (Fig. 6). Nei mutanti newbornChrd, le arterie carotidi comuni si univano direttamente al truncusarteriosus, con conseguente assenza dell’arteria brachiocefalica e parte dell’arco aortico (Fig. 6 BIS-C).Le arterie polmonari originate direttamente dal tronco prossimalearterioso, con conseguente assenza di un tronco polmonare comune(Fig. 6 BIS-C). Inoltre, sono stati osservati difetti di lateralità, con un’anormale rotazione a destra dell’aortain 40% dei mutanti (Fig. 6, confronta 6Ewith 6F). Quando le dissezioni sono state eseguite dal posteriore, si può vedere che, a seconda della lateralità dell’aorta discendente, le arterie succlavia destra o sinistra hanno adottato una posizione retroesofagea anormale (Fig. 6D-F). Simili difetti sono stati descritti in embrioni di pulcino con ablazioni di cellule di cresta neurale (Kirby et al., 1983), e inmice portando delezioni nella regione congenica DiGeorge(Lindsay et al., 1999; Merscher et al., 2001) ormutazioni in Tbx1 e Fgf8(Abu-Abu et al., 2002; Frank et al., 2002; Jerome e Papaioannou, 2001;Lindsay et al., 2001; Vitelli et al., 2002b).

Alla nascita, solo il 49% dei mutanti omozigoti Chrd attesi eraricoperto. Tuttavia, 48 dei 56 (86%) embrioni Chrd-/-previsti erano ancora vivi nelle cucciolate sezionate a E14.5, una frequenza non significativamente diversa da quella osservata a E8.5 (88%). Il forte aumento della mortalità dopo E14.5 coincide con la piena manifestazione del fenotipo cardiovascolare e suggerisce che il malfunzionamento circolatorio è una causa importante di letalità degli embrioni Chrd-/- durante la gestazione tardiva.

Anomalie faringee

Per determinare l’insorgenza del fenotipo faringeo abbiamo sezionato le femmine in gravidanza da accoppiamenti eterozigoti in momenti diversi post coitum. Alla E9.0, astage in cui il Chrd è espresso nell’endoderma faringeo, gli embrioni di Chrd – / – potrebbero essere identificati da una rientranza nella regione del collo (Fig.7A’, freccia). Le vescicole otiche dei mutanti sono state ridottea metà del loro diametro normale (Fig.7A’, punte di freccia) e il secondo arco faringeo (ioide) eramascia. Archi faringei da tre a sei mai formati in embrioni mutanti(Fig. 7B ‘ e dati notshown). Le strutture mancanti o malformate sono precursori diretti o svolgono ruoli induttivi durante lo sviluppo di molti degli organi che sono difettosi alla nascita nei topi Chrd -/ -. Poiché la maggior parte delle anomalie fenotipiche osservate nei mutanti appena nati hanno la loro origine embriologica nell’endoderma faringeo e nella regione periferica, abbiamo analizzato l’espressione di un numero di geni noti per avere importanti ruoli di sviluppo nella malattia ereditaria umana.

Abbiamo esaminato prima l’espressione di Pax3, un fattore di trascrizioneespresso nella cresta neurale, nel tubo neurale dorsale e nei somiti (Goulding et al., 1991). Inhumans, PAX3 è mutato nelle malattie della cresta neurale designate sindrome di Waardenburg tipi 1 e 3 (Strachan e Read, 1994) ed è un co-regolatore, insieme a SOX10, del gene microphthalmia orMITF (Bondurand et al., 2000), il fattore di trascrizione mutato nella sindrome di Waardenburg 2a negli esseri umani (Tassabehji et al.,1994). La mutazione di Pax3 nel topo splotch(Sp2H) provoca difetti cardiaci, tra cuipersistente tronco arterioso, così come malformazione del timo, tiroidee ghiandole paratiroidi (Conway et al.,1997). Abbiamo scoperto che l’espressione di Pax3 eraindistinguibile tra embrioni mutanti e wild-type a E7.5 (non mostrato),ma a E10.5 sono state osservate differenze significative. Le cellule della cresta Pax3-positiveneural che migrano attraverso archi faringei 3, 4 e 6(Fig. 7C, punte di freccia) sono stati scarsamente rilevabili in Chrd – / – animali (Fig. 7 QUATER”). Queste cellule neuralcrest popolano il setto che separa l’aorta dall’arteryin polmonare il tratto di deflusso, o regione conotruncal, del cuore(Li et al., 2000). Il failureof cresta neurale cardiaca per raggiungere il cuore spiega la mancanza di deflusso tractseptation e il successivo fenotipo cardiovascolare osservato mutanti inChrd. È interessante notare che l’espressione di Pax3 in altri tessuti come la componente mandibolare (md) del primo arco faringeo, i dermomiotomi(dm) e i precursori del mioblasto negli arti anteriori (fl) non è stata influenzata(Fig. 7 QUATER”).

Successivamente, abbiamo eseguito ibridazioni in situ con Sox10, un genemutated in individui con sindrome di Waardenburg tipo 4 (Pingault et al., 1998) cheè espresso in cresta neurale e cellule di Schwann. A E7. 5, l’espressione diSox10 era la stessa negli embrioni Chrd-/- e nei loro compagni di lettiera wild-type (dati non mostrati). A E9.5, Sox10l’espressione nei gangli della radice dorsale (drg) del tronco era normale(Fig. 7B, B’), ma la distribuzione delle cellule gliali che esprimono Sox10 ha rivelato specifici difetti nell’organizzazione del sistema nervoso periferico nella regione del collo e della testa dei mutanti (Fig.7 TER”). In particolare, i gangli sensoriali cranici hanno mostrato marcatianormalità. I gangli trigemino (tr) e vestibolo-cocleare (vc), corrispondenti rispettivamente ai nervi cranici V e VIII, erano localizzati più vicini negli embrioni Chrd-/- che nei compagni di tipo selvaggio. Inoltre, sono state osservate proiezioni nervose anormali che collegavano i due ditali (Fig. 7B’, punta di freccia). I gangli genicolati (g), petrosali (p) e nodosi (n), corrispondenti ai nervi cranici VII, IX e X, erano i più colpiti, mostrandoo un’estrema riduzione delle dimensioni o una completa assenza. Questi tre gangliaoriginano dai placodi epibranchiali e sono noti per richiedere segnali induttivi dall’endoderma anteriore per il loro corretto sviluppo(Begbie et al., 1999). La mancanza di gangli epibranchiali derivati dal placode indica che la proteina secreta è necessaria per l’attività del segnale induttivo rilasciato dall’endoderma faringeo.

Pax9 è un fattore di trascrizione richiesto per lo sviluppo dell’endoderma faringeo e dei suoi derivati nel topo(Peters and Balling, 1999; Peters et al., 1998). Alla E9.5, l’espressione di Pax9 nell’endoderma faringeo degli embrioni di CHRD – / – era più debole rispetto ai loro compagni wild-typelitter (pe, Fig.7D, D’). L’espressione Pax9 ha rivelato che la dimensione ela forma della faringe è stata alterata nei mutanti Chrd, con i pharyngealpouches ridotti a un singolo gonfiore nella regione più anteriore(Fig. 7E, E’). L’ipoplasia della faringe è stata confermata da sezioni istologiche di E14, 5embrios, in cui l’endoderma anteriore appariva come un tubo sottile che delineava un lume notevolmente diminuito (ph, Fig.5F, F’). La riduzione dell’endoderma faringeo è stata osservata anche nei knockdown di Xenopus Chrd(Oelgeschläger et al.,2003). Le regioni non faringee in cui l’mRNA Pax9 ènormalmente espresso, come gli sclerotomi somitici (sc) e il mesenchima facciale(fm), non hanno mostrato differenze nella distribuzione o nell’abbondanza dei trascritti (Fig.7F, F’).

Concludiamo da questi studi che le alterazioni nell’espressione di Pax3, Sox10 e Pax9 sono limitate a un’area molto limitata di domini di espressione più ampi, suggerendo che la mancanza della proteina secreta interrompe in modo specifico le vie regolatorie locali che agiscono nella regione periferica circostante l’endoderma che esprime il Chrd.

L’espressione di Tbx1 e Fgf8 richiede chordin

Per studiare l’interazione di Chrd con geni noti per causare fenotipi Digeorge o DiGeorge-like nei topi, abbiamo analizzato l’espressione diTbx1 e Fgf8 in embrioni mutanti Chrd. Tbx1è un membro della famiglia di fattori di trascrizione T-box (Papaioannou e Silver,1998). Mappa all’interno della microdelezione DGS/VCFS 22q11 negli esseri umani e recentemente è stato dimostrato di causare fenotipo DiGeorge-like su topi inattivazione (Jerome e Papaioannou,2001; Lindsay et al., 2001; Merscher et al., 2001; Vitelli et al., 2002a). Espressione di Tbx1 è stato alterato INCHRD-/- embrioni. Negli animali wild-type E7.5, Tbx1è espresso nel precedente (futuro endoderma faringeo) e mesoderma della testa(Fig. 8 BIS). In questa fase, i littermates mutanti hanno mostrato una chiara riduzione dei livelli di Tbx1expression nelle stesse aree (Fig.8 BIS”). La riduzione dell’mRNA Tbx1 era altrettanto chiara nella regione faringea degli embrioni omozigoti Chrd a E8.0, E8.5 Ee9.0 (Fig.8B’,C’,D’). Sezioni istologiche trasverseha dimostrato che a livello cellulare l’abbondanza di trascrizioni Tbx1 è stata drasticamente ridotta nell’endoderma, sia nella faringe che nella parte anteriore fino al livello del diverticolo epatico (Fig.8F-H’) Diminuzione della concentrazione di mRNA Tbx1 era evidente anche nel mesoderma, tra cui testa, splancnico (punte di freccia) e mesoderma somatico (frecce)nella regione perifaringea(Fig.8F’, G’, H’). Inoltre, l’espressione Tbx1 a E9 nel nucleo mesodermico del primo arco faringeo eradiffusa, che si estende alla maggior parte dell’arco, e le trascrizioni Tbx1 eranoassente dalla vescicola otica (Fig.8D-D’).

Fgf8 è un fattore di crescita secreto espresso in una varietà di tessuti, tra cui l’endoderma faringeo e il mesoderma vicino (Crossley e Martin, 1995;MacArthur et al., 1995).Durante lo sviluppo iniziale, Fgf8 è richiesto per la gastrulazione(Sun et al., 1999) e theestablishment dell’asse sinistro/destro di simmetria(Meyers e Martin, 1999). Atlater fasi di Fgf8 è richiesto per arto(Lewandoski et al., 2000; Luna e Capecchi, 2000) andcraniofacial (Trumpp et al., 1999) sviluppo. Recenti esperimenti hanno dimostrato che i topi con ridotta attività Fgf8 presentano uno spettro di difetti cardiovascolari e faringei che imitano da vicino la sindrome di DiGeorge(Abu-Abu et al., 2002; Frank et al., 2002). Inoltre, l’espressione di Fgf8 è abolita nell’endoderma faringeo ofTbx1 – / – mutanti ed entrambi i geni interagiscono geneticamente durante la differenziazione delle arterie dell’arco faringeo(Vitelli et al., 2002b). AtE9, l’espressione di Fgf8 in mutanti di Chrd è normale in themid-hindbrain istmo, prominenza frontonasal e coda. Tuttavia, in pharyngealendoderm, i livelli di trascrizione Fgf8 sono drasticamente ridotti(Fig. 8E’). La riduzione dell’espressione di Tbx1 e Fgf8 negli embrioni Chrd-/-ha suggerito che entrambi i geni agiscono a valle del Chrd nella stessa via regolatoria. Questi esperimenti non determinano se Chrdè richiesto per il mantenimento o per l’induzione di Tbx1 Efgf8 nella faringe e nei tessuti vicini.

Per verificare se il Chrd può indurre Tbx1 e Fgf8,abbiamo iniettato l’mRNA Chrd (50 pg) nella regione ventrale degli embrioni di Xenopus allo stadio a quattro cellule. Gli espianti della zona marginale ventrale (VMZ)sono stati sezionati all’inizio della gastrula, coltivati fino a quando gli embrioni fratelli non hanno raggiunto lo stadio iniziale della neurula e analizzati da RTPCR. Gli MRNA Tbx1 e FGF8 sono stati espressi a livelli elevati negli embrioni interi e negli espianti della zona dorsalmarginale (DMZ) in questa fase, e a livelli bassi negli espianti VMZ(Fig. 8I, corsie 1-3). Fino alla microiniezione, l’mRNA Chrd ha aumentato i livelli di Tbx1 e FGF8 in VMZ (Fig. 8I, corsia 4). Ibridazione in situ di embrioni di Xenopus microiniettati ha confermato che i trascritti Tbx1 indotti da MRN di Chrd erano localizzati nell’endoderma faringeo (dati non mostrati). Concludiamo CHRD, un antagonista del Bmp, può indurre l’espressione di Tbx1 e Fgf8 negli embrioni di Xenopus ed è necessaria per la piena espressione di questi geni nella regione faringea dell’embrione di topo.