Il cromodominio Chp1 lega la coda H3K9me e il nucleo del nucleosoma per assemblare eterocromatina

Costruzione di plasmidi e ceppi

I mutanti Chp1CD per l’espressione e la purificazione sono stati generati tramite PCR inversa utilizzando i primer elencati PET28A Chp1 plasmide di cromodominio . I test di salvataggio dell’eterocromatina sono stati eseguiti mediante introduzione di plasmidi contenenti chp1 wt e proteina mutante chp1 sotto il suo promotore endogeno in un ceppo chp1Δ (SP170, vedere Tabella supplementare S3) . il gene chp1 full-length e il suo promotore endogeno (-949 bp dall’inizio della sequenza codificante chp1+) sono stati clonati nel plasmide pREP1. i mutanti di cromodominio chp1 sono stati generati mediante PCR inversa utilizzando i primer elencati nella Tabella supplementare S2 e trasformati nel ceppo chp1Δ indicato.

Per l’integrazione genomica, il plasmide pREP1 è stato modificato per sostituire il promotore nmt1+ con la seguente cassetta di integrazione: Regione (SphI) al 5′ del gene Chp1 (Cromosoma I, 2215500-2215055) (AscI)—cassetta di resistenza HphMX6 -(SphI) Promotore endogeno Chp1 (Cromosoma I, 2214829-2214664)—Sequenza di codifica Chp1—(BamHI) Terminatore Chp1 (Cromosoma I, 2210976-2210582) (BamHI). La cassetta di integrazione (sia la cassetta chp1+ che la cassetta chp1LOOP1B/2B) è stata poi PCR amplificata e trasformata per elettroporazione, in ceppi SP101, SP170 e SP64. Le cellule sono state quindi selezionate su piastre YES+ Igromicina (50 mg ml−1 igromicina). Singole colonie sono state isolate, sottoposte a screening PCR e sequenziate per l’inserimento genomico della cassetta di resistenza HphMX6 e delle mutazioni LOOP1B/2B.

Ceppi contenenti plasmidi sono stati coltivati su Edinburgh Minimal Medium Complete (EMMC)-leu media. Tutti i ceppi e plasmidi utilizzati in questo studio sono elencati nelle tabelle supplementari S3 e S4.

Purificazione delle proteine

His6-SUMO-Chp1CD e tutti i mutanti CD sono stati espressi in E. coli BL21 (DE3) (pLys) e purificato attraverso cromatografia di affinità utilizzando resina Ni-NTA (GE Healthcare, Friburgo, Germania). His6-SUMO-Chp1CD contiene il sito di scissione della trombina tra due tag .

In totale, è stato aggiunto 0,2 mm IPTG per indurre l’espressione proteica seguita da una crescita a 18 °C O/N. Le cellule sono state raccolte per centrifugazione e ri-sospese in tampone di lisi (20 mm 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico acido (HEPES) pH 7,5, 150 mm NaCl, 1 mM ditiotreitolo (DTT), 20 mM imidazolo). Dopo il congelamento lampo, le cellule sono state scongelate e incubate per 30 min in lisozima prima della sonicazione (Branson Sonifier 250-output 4, duty cycle 40). La sospensione è stata centrifugata (12000 g, 20 min a 4 °C) e il surnatante aggiunto alla resina Ni-NTA prebilanciato in tampone legante (20 mm HEPES pH 7,5, 500 mm NaCl, 1 mM DTT, 20 mm imidazolo) e incubato per 30 min a 4 °C sotto rotazione. La resina è stata quindi lavata 5× con tampone legante e le proteine sono state eluite in tampone di eluizione (20 mm HEPES pH 7.5, 150 mm NaCl, 1 mM DTT, 300 mm imidazolo). Chp1CD wt e mutanti sono stati poi dyalized O / N in un buffer contenente 20 mm HEPES pH 7.5, 150 mm NaCl, 1 mM DTT. His6-SUMO-Chp1CD è stato quindi ulteriormente purificato mediante filtrazione in gel (Superdex 75 pg; GE Healthcare) e dializzato in un buffer contenente 20 mm HEPES pH 7.5, 75 mm KCl, 0.5 mM DTT.

Test di silenziamento

Le cellule per i test di silenziamento sono state coltivate fino a un OD 0,7–1 e quindi normalizzate fino a una concentrazione finale di 1×107 cellule ml−1 di coltura. Sono state effettuate diluizioni seriali decuplicate in modo che il punto a più alta densità contenesse 1×105 celle. Le cellule sono state individuate su piastre non selettive (SÌ) e acido 5-fluoro-orotico (5-FOA 1 g l-1 5−FOA). Le piastre sono state incubate a 32 °C per 2-3 giorni e imaged. Le cellule hanno un gene reporter ura4 inserito nelle ripetizioni imr pericentromeriche (locus eterocromatico). Quando il gene reporter ura4 viene silenziato, le cellule possono crescere su un mezzo contenente 5-FOA. Quando l’eterocromatina viene persa, il gene reporter ura4 viene espresso e le cellule non sono in grado di crescere sul mezzo 5-FOA.

Rilevazione dei livelli di RNA mediante qPCR (RT-qPCR)

Le colture di lievito (10 ml) sono state coltivate fino a un OD600 di 0,7–1,5. Le cellule sono state quindi ri-sospese in tampone di lisi da 500 µl (300 mM di NaOAc pH 5,2, 1% di sodio dodecil solfato) e 500 µl di fenolo–cloroformio e incubate a 65 °C per 10 min con miscelazione costante. La frazione acquosa è stata separata dal fenolo-cloroformio mediante centrifugazione (10 min, 20 000 g) e l’etanolo precipitato. Gli acidi nucleici sono stati trattati con DNasi I (Roche, Basilea, Svizzera) per 30 minuti a 37 °C seguiti da 15 minuti a 75 °C di inattivazione termica. Il DNA complementare è stato sintetizzato utilizzando 100 ng di RNA e 1 pmol di DNA oligos con Apice III (Invitrogen, Darmstadt, Germania) utilizzando condizioni standard. I livelli di RNA sono stati quantificati con qPCR utilizzando il kit Biozym DyNAmo Flash qRT-PCR e normalizzati al gene eucromatico tdh1.

Test di spostamento della mobilità elettroforetica dell’RNA

Il test di spostamento dell’RNA è stato eseguito seguendo le condizioni precedentemente riportate . In totale, 0.66 pmol di RNA centromerico 30 nt radiomarcato da 32P sono stati incubati con 10 µM di cromodominio Chp1 (wild-type e mutante) in un tampone contenente 20 mM di Tris-HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT e 3% di glicerolo. Per l’RNA EMSA con 100 trascritti centromerici dg nt, 2 pmol di RNA radiomarcato 32P sono stati incubati con 0, 2 (1:1), 10 (1:5), 20 (1:10) pmol della proteina Chp1CD (mutante wt e LOOP1B/2B) in 15 µl di volume finale. Il peptide H3K9me3 (Eurogentec, Köln, Germania) è stato aggiunto a un peptide 1:1 Chp1CD – H3K9me, come riportato in . L’incubazione è stata effettuata per 1 ora su ghiaccio e i campioni (20 µl di volume finale) sono stati poi caricati su un gel nativo di acrilammide-TBE al 10% (rapporto Bis-acrilammide 1:29). Per i pull-down di RNA in vitro, 1 µg di SUMO-Chp1CD (mutante wild-type e LOOP1B/2B) è stato legato a 15 µl di resina Ni-NTA (GE Healthcare) e il H3K9me3Nucleosoma è stato aggiunto per assemblare il complesso Chp1CD-H3K9me3Nucleosoma in buffer di legame (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mm KCl, 0,5 mM DTT, 20 mm imidazolo). Dopo aver lavato tre volte con 50 µl di tampone legante, sono stati aggiunti 2 pmol di RNA dg 100nt marcato con 32P e incubati con la resina nucleosoma Chp1CD su ghiaccio per 1 h. La resina è stata centrifugata a bassa velocità (60 g, 10 s) e il flusso attraverso raccolto. La resina è stata lavata per tre volte con almeno 3× (v/v) Binding buffer e il complesso Chp1CD-Nucleosoma-RNA è stato eluito mediante aggiunta di 300 mm imidazole buffer (20 mm HEPES pH 7.5, 75 mm KCl, 0.5 mM DTT, 300 mm imidazole), incubato per 1 h su ghiaccio con 5 min intervallo di miscelazione (frazione legata). I campioni sono stati caricati su un gel di acrilammide nativo al 10% TBE (rapporto Bis-acrilammide 1:29) e eseguiti per 2 ore a 10 mA a 4 °C. Dopo l’esposizione notturna, i gel sono stati scansionati utilizzando il TyphoonFLA9000 phosphoimager.

Immunoprecipitazione della cromatina

Le colture di lievito (100 ml) sono state coltivate fino a un OD600 di 0,7 e reticolate con il 3% di formaldeide a temperatura ambiente per 15 min come descritto . La reazione è stata spenta con 125 mm di glicina per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule sono state ri-sospese in tampone di lisi da 500 µl (50 mm HEPES pH 7.5, 1.5 M acetato di sodio, 5 mm MgCl2, 2 mm acido etilendiamminotetraacetico, 2 mM glicole etilenico acido tetraacetico, 0,1% NP-40, 20% glicerolo) contenente inibitori della proteasi (compresse cocktail inibitore della proteasi, Roche, Completo, privo di acido etilendiamminotetraacetico). Le cellule congelate sono state lisate utilizzando il bead beater MP Biospec. Dopo la lisi, l’estratto è stato sonicato 35× per 30 s (Bioruptor, Diagenode, Seraing, Belgio) e filato a 13 000 g per 15 min per ottenere il surnatante cromatina. Per il DNA in ingresso, sono stati utilizzati 50 µl del surnatante. Per le immunoprecipitazioni, i supernatanti sono stati normalizzati in base alla concentrazione proteica e incubati con anticorpo anti-dimetilato H3K9 o anticorpo anti-Chp1 (H3K9me2, Abcam no. Ab1220 e Chp1, Abcam no. Ab18191), immobilizzato su Dynabeads magnetici, per 2 h a 4 °C. Le perle e la proteina immobilizzata sono state lavate 5× con 1 ml di tampone di lisi. Le proteine sono state eluite incubando con 150 µl di tampone di eluizione (50 mM di Tris-HCl pH 8,0, 10 mm di acido etilendiamminotetraacetico, 1% di sodio dodecil solfato) a 65 °C per 15 min. I collegamenti incrociati sono stati invertiti mediante incubazione a 65 ° C durante la notte seguita dalla degradazione dell’RNA con RNasi A e dalla degradazione delle proteine con Proteinasi K. Il DNA è stato quindi recuperato mediante estrazione di fenolo-cloroformio e precipitazione di etanolo e quantificato utilizzando qPCR. Il gene eucromatico tdh1 è stato utilizzato per la normalizzazione. Gli oligonucleotidi utilizzati nei test di immunoprecipitazione della cromatina sono elencati nella tabella supplementare S2.

Ricostituzione in vitro dei nucleosomi e metilazione (H3K9me3)

I nucleosomi sono stati ricostituiti utilizzando istoni Xenopus laevis e la sequenza 601 come precedentemente descritto . La metilazione in vitro è stata eseguita come descritto . Il picco a + 42 Da è stato osservato nella pubblicazione originale e non è una contaminazione (Matt Simon, comunicazione personale e descritto in ).

In vitro Chp1CD–H3K9me3 Formazione ed eluizione del complesso nucleosomico MLA

In totale, 5 µg di Chp1CD sono stati legati a 15 µl di resina Ni-NTA in tampone legante (20 mm HEPES pH 7,5, 75 mM KCl, 0,5 mM DTT, 20 mm imidazolo) per 20 min a 4 °C. La resina è stata lavata una volta con cinque volumi di tampone legante e sono stati aggiunti 10 µg di nucleosomi H3K9me3 metil lisina analogica (MLA) (i nucleosomi MLA erano precedentemente dializzati in tampone legante) in un volume finale di 20 µl e incubati 1 h su ghiaccio con re-sospensione costante ogni 5 min. Dopo l’incubazione, la resina è stata centrifugata (60 g per 10 s) e il flusso attraverso raccolto. La resina è stata poi lavata tre volte con cinque volumi di tampone legante. Il complesso SUMO-Chp1CD-H3K9me3Nucleosoma è stato eluito aggiungendo trombina (Sigma, Monaco, Germania) per 2 h su ghiaccio in 20 µl di buffer di legame. La formazione di complessi è stata poi valutata mediante elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide su gel di acrilammide al 15% e mediante colorazione negativa EM.

Chp1CD H3K9ME3 peptide-binding assays

In totale, 1 µg di-Istone H3 (1-21)-GGK(Biotina) peptide (Eurogentec) è stato incubato con 15 µl di streptavidin agarose resin (Invitrogen) in 20 mm HEPES pH 7.5, 75 mm KCl, 0.5 mM DTT. Circa 5 µg di Chp1CD (sia wt che mutanti) sono stati quindi aggiunti in un volume finale di 20 µl e incubati per 1 ora su ghiaccio nelle stesse condizioni tampone. La resina è stata lavata tre volte e quindi l’efficienza di legame è stata valutata mediante elettroforesi su gel SDS-poliacrilammide su gel di acrilammide al 15%. La quantificazione del binding è stata effettuata utilizzando il software ImageJ. Il legame di ciascun mutante è stato normalizzato in peso Chp1CD per ciascun test.

Microscala termoforesi (MST)

Per MST tag SUMO è stato rimosso da Chp1CD costrutti con Ulp1 proteasi. In totale, 100 µg di Chp1CD wild-type e mutante sono stati etichettati in modo fluorescente utilizzando il kit di etichettatura delle proteine Monolith MO-L003 BLUE-NHS (Amine Reactive) secondo le istruzioni del produttore (Nanotemper Technologies, Monaco di Baviera, Germania). Un rapporto 1: 1 Fluorescenza: proteina è stato stimato utilizzando la funzione ‘Proteine ed etichette’ del software Nanodrop1000 e ogni cromodominio Chp1 è stato eseguito su un gel di acrilammide SDS al 15% per normalizzare le concentrazioni a 0,1 mg ml−1.

Le reazioni sono state assemblate in 20 µl con 300 ng di Chp1CD fluorescente e quantità crescenti di-Istone H3 (1-21)-peptide GGK(Biotina) (Eurogentec) o H3K9ME3NUCLEOSOMI, in un tampone contenente 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mm NaCl, 0,5 mM DTT e 0,05% Tween-20. Per i test H3K9me3Nucleosomes-binding glicerolo è stato aggiunto al 10% concentrazione finale. Per i test H3K9me3 queste diluizioni sono state utilizzate per le misurazioni: 0 nM, 9 nM, 13 nM, 20 nM, 31 nM, 46 nM, 70 nM, 105 nM, 158 nM, 237 nM, 355 nM, 530 µM, 800 µM, 1,2 µM, 1,8 µM. Per il test H3K9me3Nucleosoma abbiamo usato le seguenti diluizioni per le misurazioni: 0 nM, 18 nM, 27 nM, 41 nM, 62 nM, 93 nM, 140 nM, 210 nM, 316 nM, 474 nM, 711 nM, 1,06 µM, 1,2 µM, 1,4 µM, 1,6 µM, 2,4 µM.

Le esecuzioni MST sono state eseguite utilizzando capillari trattati standard (Nanotemper Cat#K002) sul NT.115 Strumento monolite. Tutte le misurazioni sono state eseguite utilizzando l ‘ 80% di LED e il 40% di potenza MST, con 30 s Laser On time e 5 s Laser Off time. Per ogni esperimento sono state eseguite cinque singole misurazioni.

I dati sono stati analizzati con il software GraphPad Prism versione 6.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) e il software SigmaPlot versione 13.0 (Systat Software, San Jose, CA, USA). Per i test di legame peptidico, con le curve che mostrano una tendenza sigmoide distinta, abbiamo montato l’equazione sigmoidale asimmetrica logistica a cinque parametri Richards e calcolato automaticamente il Kd. Per i test H3K9me3Nucleosome-binding, poiché la tendenza dei dati grezzi non era più sigmoide per tutte le proteine analizzate, è stata utilizzata un’equazione polinomiale (cubica) del terzo ordine per il montaggio e il confronto dei punti di dati grezzi di Chp1CD wild-type e dei diversi mutanti. Kd è stato calcolato sulla base della funzione ‘Interpolazione’ del software GraphPad prism, utilizzando il valore associato/non associato al 50% sull’asse y.

Digestione della tripsina del nucleosoma

I nucleosomi senza coda sono stati preparati incubando nucleosomi ricostituiti con una resina immobilizzata TPCK-tripsina (termoscientifica) per 2 h a temperatura ambiente in un tampone contenente 20 mm HEPES pH 7.5, 75 mM KCl, 0.5 mM DTT . La digestione triptica genera bande istoniche molto definite ed è stata caratterizzata in dettaglio dove esattamente la tripsina taglia .

Saggi di legame ai nucleosomi con mutanti Chp1CD

I saggi di legame ai nucleosomi Chp1CD wild-type e mutanti sono stati eseguiti come descritto in precedenza per la formazione del complesso nucleosomico Chp1CD-H3KC9me3 MLA in 20 mm HEPES pH 7.5, 100 mm KCl, 0.5 mM DTT, 40 mm imidazolo. Resine e input sono stati eseguiti su SDS-poliacrilammide gel elettroforesi 15% acrilammide gel. Tutti i campioni sono stati poi analizzati da immunoblot con istone anti-H3 (AbCam, Cambridge, UK, 1: 1000), o anticorpo anti-H3K9me3 (AbCam, 1: 1000), anti-capra IgG-HRP (BioRad, 1:3000) anti-coniglio IgG-HRP (BioRad, Monaco di Baviera, Germania, 1:3000).

Microscopia elettronica a macchia negativa

Dopo l’eluizione della trombina, 3 µl del complesso nucleosomico Chp1CD–H3KC9me3 sono stati individuati su una griglia di rame scaricata a incandescenza (Cu 400 mesh Q11916, Quantifoil, Großlöbichau, Germania) rivestita con una pellicola di carbonio da 1 nm per 45 s. Dopo un rapido lavaggio con acqua, la griglia è stata% Acetato di uranile. Le immagini negative delle macchie sono state raccolte su un microscopio elettronico a trasmissione FEI Morgagni.

Crio-EM sul complesso nucleosomico Chp1CD–H3KC9me3

Le griglie crio-EM (griglie rivestite di carbonio Holey, strato di carbonio Cu 300 Mesh R3/3+1 nm, Quantifoil) sono state preparate utilizzando un marchio Vitrobot IV (società FEI). I dati crio-EM sono stati raccolti utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione Titan-Krios (FEI Company, Hillsboro, OR, USA) a 200 keV e un ingrandimento di 113 000× sul piano del CCD utilizzando una fotocamera CMOS F816 (TVIPS GmbH, Gauting, Germania) con una dimensione in pixel dell’immagine di 1,2 Å per pixel sulla scala dell’oggetto (la dimensione in pixel del CCD era di 13,6 µm). Per la raccolta automatica dei dati è stato utilizzato il software EM-TOOLS e i dati sono stati raccolti in un intervallo di sfocatura di 10 000-40 000 Å.

In totale, 2 480 micrografie per il complesso Chp1CD–H3KC9me3 e 991 micrografie per il controllo dei nucleosomi H3KC9me3, rispettivamente, sono stati selezionati per l’analisi a particella singola utilizzando il pacchetto software Xmipp (Figura supplementare S9A) . Poche migliaia di particelle sono state raccolte manualmente e accuratamente pulite dal rumore. Queste particelle sono state poi utilizzate per il prelievo di particelle semiautomatico e automatico in XMIPP. La funzione di trasferimento del contrasto è stata determinata da CTFFIND3 . Le singole particelle selezionate sono state convertite in formati SPIDER e RELION per ulteriori analisi (figura supplementare S9B). Le medie di classe bidimensionali sono state generate con il pacchetto software RELION (Figura supplementare S9C). Le medie di classe non valide sono state rimosse da ulteriori analisi dei dati. I perfezionamenti tridimensionali sono stati successivamente eseguiti con i pacchetti software SPIDER e RELION .

La classificazione delle particelle non supervisionata è stata eseguita mediante semina casuale con le mappe di densità complete senza classificazione mirata nel pacchetto software SPIDER. I tentativi di utilizzare una classificazione mirata hanno determinato un forte pregiudizio e un eccesso di rumore nelle regioni di interesse. Pertanto, non abbiamo usato la classificazione focalizzata per ridurre i pregiudizi. Nella classificazione iniziale fatta in SPIDER, le classi C0–C6 e N0-N5 sono state backprojected usando angoli da mappe C0 e N0 e queste classi non sono state completamente raffinate. Qui volevamo solo selezionare classi con densità aggiuntiva legata al nucleosoma. Particelle che generano mappe con diverse densità di Chp1CD sono state separate e ulteriormente classificate. Sono stati eseguiti circa 20 round di classificazioni di semina casuali fino a quando non abbiamo partizionato le particelle in cinque diversi gruppi (Figura supplementare S3). Le classi C11-C15 sono state perfezionate con il pacchetto software RELION. I perfezionamenti finali dei complessi di Chp1CD-H3K9me3Nucleosome (classe C15) e controllo nucleosoma sono stati fatti con il pacchetto software RELION. Per il raffinamento finale il riferimento è stato filtrato a ~50 Å (filtro RELION). Il riferimento che abbiamo usato non aveva nessuna delle caratteristiche osservate nelle ricostruzioni raffinate (la doppia elica del DNA non è risolta, il solco maggiore non è visibile, le α-eliche non sono risolte). Questo indica nessun pregiudizio di riferimento nella nostra struttura. La risoluzione del controllo del nucleosoma ha raggiunto 7,3 Å utilizzando l’auto-raffinazione in RELIONE e la simmetria C2 (FSC 0,143 cutoff di due mappe raffinate in modo indipendente). Il complesso di Chp1CD-H3K9me3Nucleosome è stato raffinato a 10 Å (FSC 0.143 cutoff di due mappe raffinate indipendentemente) senza simmetria applicata.

La risoluzione locale è stata calcolata utilizzando il software ResMap (volume singolo finale, minRes=7, maxRes=14, automask). La risoluzione media determinata da Resmap è di 9,4 Å per il complesso Chp1CD-H3K9me3Nucleosoma, confermando indipendentemente la risoluzione media precedentemente determinata di 10 Å (FSC 0,143) (Figura 1c). Per Chp1CD-H3K9ME3LA risoluzione locale complessa del nucleosoma per il nucleosoma è 9-10 Å e per il ligando ~10 Å (Figura 2a). La distribuzione dell’angolo di Eulero per le ricostruzioni finali è mostrata sia per il nucleosoma che per il complesso Chp1CD-H3K9me3Nucleosoma (figura supplementare S9D). Tutti gli orientamenti sono presenti con una preferenza per le viste superiore e laterale.

I modelli molecolari sono stati costruiti utilizzando il pacchetto software Chimera utilizzando il montaggio del corpo rigido di strutture cristalline . L’adattamento alla densità è stato fatto con le opzioni Chimera ‘Fit in Map’ e ‘Fit in Segments’ con solo piccole regolazioni manuali. Segmentazione e visualizzazione di tutte le mappe crio-EM è stato fatto con il software Chimera pure .