Her-2/neu stato può essere rilevato analizzando il numero di copie del gene di Southern blotting, PCR, o di PESCE, o la quantità di proteina espressa può essere accertata mediante Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay, o IHC. I due metodi più utilizzati al momento sono IHC e FISH perché sono in grado di valutare Her-2/neu in tessuti d’archivio con paraffina fissata alla formalina.
La maggior parte degli studi Her-2 / neu sono stati eseguiti da IHC, che rileva la sovraespressione del prodotto proteico Her-2/neu sulla membrana cellulare delle cellule tumorali. Questo studio ha utilizzato l’anticorpo monoclonale CB11, che, come l’HercepTest policlonale standardizzato, è diretto contro il dominio intracitoplasmatico della molecola Her2/neu .
IHC è ampiamente accessibile e facile da eseguire ad un costo ragionevole. Tuttavia, questa procedura semi-quantitativa è afflitta da artefatti tecnici, differenze di sensibilità tra diversi anticorpi e interpretazione soggettiva, con conseguente variabilità interobserver tra patologi . Gli studi rivelano l’eccessiva sensibilità di US Food and Drug Administration-approvato HercepTest, con un tasso di falsi positivi alto come 50%. Thomson e colleghi hanno concluso che nei casi con un’intensità di macchia IHC di 1 + o 2+, l’accordo interobserver è scarso e il valore predittivo è insoddisfacente per l’uso clinico; hanno raccomandato ulteriori test, preferibilmente con PESCE .
Il PESCE è una procedura abbastanza obiettiva e quantitativa nel rilevare l’amplificazione del gene Her-2/neu sui nuclei delle cellule tumorali. Gli svantaggi di questa procedura sono il suo costo ripido (10 volte quello di IHC), la sofisticazione, la necessità di un microscopio a fluorescenza, il segnale temporaneo (richiede una telecamera speciale) e la sua incapacità di rilevare e valutare l’istomorfologia tumorale.
La sovraespressione Her-2/neu rilevata da IHC è altamente correlata con l’amplificazione genica rilevata da FISH (fino al 98% di concordanza) . Tuttavia, il 3-15% dei carcinomi mammari mostra una colorazione moderata della membrana Her-2/neu senza evidenza di amplificazione. Il più delle volte rappresentano una colorazione aspecifica altamente sensibile (falso positivo) e, raramente, una maggiore trascrizione dell’mRNA in assenza di amplificazione o amplificazione genica al di sotto del livello di rilevamento dei metodi di ibridazione in situ .
Kakar e colleghi hanno concluso che l’IHC è appropriato per la valutazione iniziale di Her-2/neu, ma i pazienti i cui tumori hanno ottenuto un punteggio inferiore a 3+ (in particolare quelli interpretati come 2+) trarrebbero beneficio da FISH per valutare lo stato di Her-2/neu in modo più accurato e per evitare una prognosi imprecisa e un trattamento inappropriato .
CISH è un recente avanzamento nel rilevamento Her-2/neu. Utilizza una robusta sonda a sequenza unica sviluppata per l’ibridazione in situ ed è una promettente alternativa pratica al PESCE. Dopo il primo studio CISH di Tanner e colleghi , altri sette rapporti hanno convalidato favorevolmente i risultati CISH . La concordanza tra PESCE e PESCE variava dall ‘ 85% al 100%. Tutti questi rapporti hanno notato i vantaggi del CISH rispetto al PESCE: richiede un normale microscopio; il metodo è meno ingombrante e più economico; l’intensità del segnale è permanente; e i patologi hanno familiarità con i segnali IHC e sono in grado di correlare i risultati con l’istomorfologia tumorale sottostante. CISH consente agli osservatori di selezionare campi di carcinoma duttale invasivo, evitando focolai di carcinoma intraduttale per i quali Her-2/neu ha un significato clinico diverso. CISH è un metodo specifico, sensibile e facilmente applicabile per il rilevamento dell’amplificazione del gene Her-2 / neu e può essere utilizzato insieme a IHC per la valutazione di pazienti con carcinoma mammario . Ross e colleghi hanno recentemente esaminato lo stato attuale dei test Her-2/neu e hanno concluso che CISH è una tecnica basata su geni più conveniente che sta “aspettando dietro le quinte”.
In questo presente studio, la concordanza tra 3+ IHC e casi amplificati da CISH era del 100% (40 su 40), indicando che tutti i casi amplificati dal gene sovraesprimevano la proteina Her-2/neu. Al contrario, l’accordo sui casi 2+ IHC e CISH-amplificati era solo 45%, che è inferiore a quanto riportato in precedenza (93%) . Il 13,75% (22 su 160) IHC-positivi/CISH tumori non amplificati in questo studio, che aveva tutti i punteggi 2+ IHC, è superiore al risultato falso positivo 6% da Zhao e colleghi, anche se paragonabile al risultato 17% (IHC CB11 contro FISH) ottenuto da Tubbs e colleghi . Apparentemente, troviamo che il punteggio 2+ IHC è equivoco rispetto a CISH. Questo sottoinsieme potrebbe beneficiare di ulteriori test di riflesso CISH. Tutti i casi negativi di IHC sono stati CISH non amplificati, mostrando il completo accordo di tutti i risultati negativi. La concordanza complessiva dell ‘ 86,25% tra IHC (utilizzando l’anticorpo CB11) e CISH in questo studio è inferiore rispetto ai precedenti rapporti (94-96%). Siamo d’accordo con Sapino e colleghi che l’analisi di amplificazione genica può essere evitata in tutti i casi 0, 1+ e 3+ IHC perché i risultati sono prevedibili da IHC e sono completamente concordanti con CISH . L’utilità di CISH è quindi nel testare ulteriormente l’alterazione Her-2/neu su casi equivoci in IHC, che rimane il metodo di screening primario. L’algoritmo combinato IHC–CISH fornisce dati Her-2/neu economici e completi per guidare i medici nella mappatura delle opzioni di trattamento.
La categoria CISH a bassa amplificazione (segnali 6-10) era la più difficile da interpretare, richiedendo un’accurata enumerazione della copia genica. Il clustering del segnale, più probabilmente il risultato dell’amplificazione intracromosomiale delle regioni di colorazione omogenea, è stato immediatamente evidente in casi altamente amplificati ed è stato facilmente valutato .
Un test per l’aneuploidia del cromosoma 17 non è stato eseguito su saggi CISH non amplificati e poco amplificati, perché studi recenti hanno dimostrato che rende l’analisi più costosa e dispendiosa in termini di tempo senza aggiungere dati pertinenti, oltre a riportare il numero raccomandato di ampliconi nucleari e ad agire come un’altra forma di controllo interno per la reazione di ibridazione . Inoltre, anche se il produttore (Zymed) ha suggerito che il cromosoma 17 aneuploidia essere testato su tutti i gene-amplificato casi, siamo d’accordo con Vera-Romana e colleghi , che ha correttamente osservato che, poiché la maggior parte polysomy risultati rientrano nella “zona grigia” di tre-cinque segnali, la soglia di segnale di chiusura punti a un massimo di sei o più (come in questo studio), elimina virtualmente la polysomy variabile.
Questo studio non ha osservato tumori CISH-amplificati IHC-negativi. Questo può probabilmente essere spiegato dal fatto che si trattava di uno studio a singola istituzione che probabilmente aveva blocchi di paraffina di tessuto tumorale uniformemente fissati e trattati, nonché una tecnica di recupero dell’antigene uniforme, che facilita entrambi i processi IHC di alta qualità. Zhao e colleghi hanno riportato casi occasionali IHC-negativi CISH-amplificati, e hanno ritenuto che questi rappresentano una piccola percentuale indeterminata che ha amplificato Her-2/neu senza sovraespressione . Lo stesso studio e altri studi sui PESCI hanno anche notato rari tumori 3 + IHC che non erano amplificati (falsi positivi) . Le ragioni addotte per le discrepanze IHC–CISH sono simili a quelle tra IHC e FISH, come affermato in precedenza nella presente relazione.
Le cause del fallimento del test e della falsa negatività offerte da precedenti studi CISH erano un’assenza di tumore sulla sezione, un’incapacità di segnare a causa di un background elevato, una bassa intensità del segnale nonostante prove ripetute, un’assenza di segnali dal controllo interno e l’uso di fissativo alcol–formalina–acido acetico . È stato inoltre osservato che il pretrattamento termico e la digestione con pepsina sono le procedure più critiche per prestazioni CISH ottimizzate e che i tassi di successo di CISH erano bassi quando sono stati utilizzati blocchi di tessuto di 20 anni .
Sauer e colleghi hanno correlato i risultati IHC e FISH con la prognosi clinica. Hanno notato che i casi IHC / FISH-positivi così come i casi FISH-positivi avevano la stessa prognosi per quanto riguarda la sopravvivenza, mentre i casi IHC-positivi avevano una prognosi simile a quella dei tumori IHC/FISH-negativi. Al contrario, i casi IHC-negativi/FISH-positivi avevano una probabilità di sopravvivenza simile a quella dei casi IHC/FISH-positivi. Gli stessi autori hanno concluso che se solo IHC fosse usato come strumento primario, i casi IHC-negativi/FISH-positivi sarebbero mancati; quelle donne non avrebbero il beneficio di trastuzumab e la loro sopravvivenza ne sarebbe influenzata negativamente. Al contrario, i tumori IHC-positivi-solo sembrano appartenere a un gruppo prognostico migliore, e il mancato rilevamento di loro probabilmente non avrebbe un effetto negativo sulla sopravvivenza .
Poiché gli studi di outcome clinici devono ancora affrontare l’utilità dei risultati CISH a bassa amplificazione e ad alta amplificazione, in particolare il significato incerto del gruppo a bassa amplificazione, queste categorie sono ancora in flusso. Nonostante questa limitazione, al momento è ancora utile segnalare separatamente tali gruppi amplificati, in attesa di qualsiasi associazione clinica sarà ottenuta in futuro. La variabilità intraobserver e interobserver sulla segnalazione dei risultati CISH a bassa amplificazione e ad alta amplificazione non è stata inclusa in questo studio, sebbene il patologo che ha interpretato i test CISH abbia applicato coerentemente i criteri stabiliti dai produttori.
Il cancro al seno nelle donne in premenopausa ha un profilo biopatico diverso da quello dei pazienti più anziani, con una predominanza di parametri prognostici sfavorevoli, tra cui una maggiore frequenza di tumori di grado 3 e una più frequente sovraespressione Her2/neu . La giovane età serve come misura surrogata dei profili prognostici avversi . Questo studio non è riuscito a stabilire l’associazione tra lo stato della menopausa, che è stato fissato arbitrariamente a 50 anni e oltre, e l’alterazione di Her2/neu.
L’amplificazione Her2/neu era direttamente correlata al grado e al tipo istologico di tumore al seno . Sapino e colleghi hanno suggerito che, sulla base del grado tumorale e del tipo istologico, il patologo dovrebbe essere in grado di indicare all’oncologo quale cancro al seno richiede analisi Her2/neu . Tuttavia, mentre nessuno dei quattro tumori ben differenziati ha mostrato amplificazione Her2 / neu o sovraespressione, nessuna correlazione significativa è stata raccolta in questo studio in termini di stato Her2/neu e grado istologico; quindi ci abboniamo ancora a testare Her2/neu su tutti i tumori al seno di nuova diagnosi. Nel complesso, la distribuzione per età dei pazienti affetti da tumore al seno e il grado istologico tumorale non hanno predetto in modo significativo lo stato IHC e CISH Her2 / neu.