Hidden in plain sight–molto abbondante e varia planctoniche di acqua dolce Chloroflexi

l’Abbondanza e la diversità del phylum Chloroflexi in ambienti d’acqua dolce

Basato su 16S rRNA leggere abbondanza da 117 metagenomica da laghi, bacini, fiumi, i rappresentanti del phylum Chloroflexi composto fino al 7% del procariote comunità epilimnion (Fig. 1a, b), tuttavia, con grandi fluttuazioni. Simile alle osservazioni precedenti, il lignaggio CL500-11 ha dominato i campioni di ipolimnione (raggiungendo almeno il 16% in tutti tranne un campione e quasi il 27% in un campione del lago Biwa) (Fig. 1c), a parte un gruppo meno noto denominato cluster TK10. La maggior parte delle sequenze rRNA 16S correlate a TK10 nel database SILVA proviene dal suolo, dalla pelle umana o da campioni metagenomici sconosciuti, mentre solo quattro (1,5%) provengono da acque dolci (File aggiuntivo 1: Figura S1A).

Sorprendentemente, i campioni epilimnion sono stati dominati da sequenze affiliate a “SL56 marine group” (fino a ca. 5% della comunità procariotica totale). SL56-relative sequenze di SILVA sono stati recuperati da un lago d’acqua dolce e il Global Ocean Series dataset (GOS) . Tuttavia, il campione GOS da cui sono stati descritti è in realtà un set di dati di acqua dolce, Lake Gatun (Panama). È abbastanza evidente dai nostri risultati (Fig. 1; File aggiuntivo 1: Figura S2) che questo ammasso si trova costantemente solo in laghi, bacini idrici e fiumi, ma non nell’habitat marino, suggerendo che è stato erroneamente indicato come un “gruppo marino.”Un altro gruppo di sequenze, denominato JG30-KF-CM66, descritto da diversi ambienti (mucchio di rifiuti minerari di uranio, suolo, acqua dolce, colonna d’acqua marina e sedimenti), è risultato essere distribuito preferenzialmente nei fiumi (in particolare nel rio delle Amazzoni) rispetto ai laghi (Fig. 1a, b), anche se con abbondanze molto basse (massimo 1% dei procarioti totali). Abbondanze simili sono state trovate nel Mar Caspio salmastro (profondità 40 m e 150 m) (File aggiuntivo 1: Figura S2).

Tuttavia, non abbiamo trovato alcun supporto per la presenza del cluster SAR202 o del suo clade fratello d’acqua dolce CL500-9 in tutti i set di dati metagenomici d’acqua dolce esaminati. In habitat marini e salmastri, SAR202 si trovano quasi esclusivamente negli strati afotici scuri, dove rappresentano fino al 30% della comunità procariotica . Se ci sono cladi correlati a SAR202 negli habitat di acqua dolce, non sono certamente molto abbondanti o forse non provengono dalla colonna d’acqua nel rapporto originale (File aggiuntivo 1: Figura S1). Nel complesso, anche se le abbondanze relative di Cloroflexi nell’epilimnia d’acqua dolce sono molto più basse che nelle acque più profonde, ospitano una ricca e diffusa collezione di nuovi gruppi.

Con queste osservazioni, è anche facilmente evidente che negli ambienti acquatici esaminati qui (acqua dolce, salmastra e marina), la diversità dei rappresentanti del Cloroflexi è sostanzialmente diversa, con gli ambienti d’acqua dolce che ospitano un assortimento filogeneticamente più diversificato di gruppi rispetto al salmastro o al marino. Inoltre, vi è una chiara evidenza della presenza di gruppi di sole acque dolci (ad es., SL56) e solo gruppi marini e salmastri (SAR202), ribadendo che la salinità è una barriera verso le transizioni di habitat microbici tra ecosistemi d’acqua dolce e marini . Non è affatto una barriera insormontabile come transizioni relativamente recenti da acqua dolce a marina (ad esempio, l’acqua dolce “Ca. Methylopumilus spp.”e marine OM43) e al contrario (marine Pelagibacter e acqua dolce LD12) sono stati entrambi proposti. Tuttavia, è probabile che i gruppi trovati in ambienti salmastri possano forse essere semplicemente “innescati” meglio per incursioni più riuscite. Troviamo esempi di gruppi presenti nei metagenomi d’acqua dolce e salmastra (JG30-KF-CM66 e CL500-11).

I principali rappresentanti del Cloroflexi d’acqua dolce

Binning automatizzato di contigs correlati al Cloroflexi da assiemi di ogni 57 set di dati appartenenti a 14 ambienti diversi (28 laghi/serbatoi, 26 fiumi e 3 set di dati salmastri) ha portato alla segregazione di 102 MAG (genomi assemblati con metagenomi) in totale (File aggiuntivo 2: Tabella S1). L’analisi filogenomica delle RIVISTE con completezza del 30% o superiore (n = 53) mostra che una notevole diversità di RIVISTE è stata recuperata da praticamente tutte le classi di Cloroflexi ben note (Fig. 2). Trentacinque RIVISTE costituivano tre nuovi lignaggi separati a livello di classe senza rappresentanti colti disponibili (SL56, TK10 e JG30-KF-CM66).

Mentre fluorescenza l’ibridazione in situ seguita da catalizzata reporter deposizione (CARD-FISH) ha rilevato un alto numero di CL500-11 cellule nel Lago di Zurigo epilimnion durante parziale mixis in inverno, il picco di livelli di abbondanza sono sempre trovato nelle zone più profonde, sia il Lago di Zurigo (fino al 11% di tutti i procarioti; Fig. 3a) e Lago Biwa (fino al 14%; Fig. 3d). L’abbondanza CL500-11 è correlata negativamente sia con la temperatura che con la concentrazione di clorofilla a (file aggiuntivo 1: Figura S3). Nei campioni del serbatoio di Řimov, tuttavia, CL500-11 era al di sotto del limite di rilevamento (< 0,18%), suggerendo che questo habitat relativamente poco profondo (profondità massima 43 m) non rappresenta una nicchia preferita per questo gruppo di batteri (File aggiuntivo 1: Figura S4). Le celle CL500-11 sono state precedentemente visualizzate da CARD-FISH e hanno dimostrato di essere grandi celle curve . Forme e dimensioni simili sono state osservate in campioni di PESCE del lago di Zurigo con lunghezze medie di 0,92 µm (intervallo 0,4–1,6 µm; n = 277) e larghezze di 0,28 µm (intervallo 0,19–0,39 µm). Analisi dei volumi cellulari (mediana 0.06 µm3) e biomassa per questo cluster rispetto a tutti i procarioti (Fig. 3c) suggerisce un contributo estremamente elevato della popolazione CL500-11 alla biomassa microbica totale. Il loro rapporto biomassa / abbondanza è di quasi 2, vale a dire, al 10% di abbondanza comprendono quasi il 20% della biomassa procariotica totale, indicando un notevole adattamento all’ipolimnione profondo relativamente oligotrofico, raggiungendo popolazioni elevate anche con le loro grandi dimensioni cellulari.

Abbiamo recuperato 11 RIVISTE (10 acque dolci, 1 salmastra) per CL500-11 in totale. Tutte e quattro le RIVISTE del lago Biwa di diversi mesi formano un’unica specie. Tuttavia, le due specie del lago di Zurigo sembrano coesistere durante tutto l’anno (marzo, maggio e novembre) con una specie che si ramifica insieme al MAG precedentemente descritto del Lago Michigan (CL500-11-LM) e le altre specie che hanno stretti rappresentanti anche nel Caspio salmastro (> 95% ANI) e modelli di reclutamento di frammenti metagenomici simili (Figs. 2 e 4c). Proponiamo il candidato genere Profundisolitarius (Pro. fun.di.so. li. ta’ri.us. L. adj. profundus profondo; L. adj. solitarius solo; N. L. masc. n. Profundisolitarius a sole recluse dal profondo) all’interno di Candidatus Profundisolitariaceae fam. ov. per il cluster CL500-11 (classe Anaerolinea).

D’altra parte, il gruppo SL56 è il lignaggio dominante nel bacino di Řimov (massimo 1.1%), sia da 16S rRNA e CARD-PESCE analisi (Fig. 1 e 3). Abbondanze massime sono state quasi sempre trovati a circa 5-20 m a temperature di ca. 15 °C, suggerendo che questo gruppo è principalmente epilimnetico (file aggiuntivo 1: Figure S3 e S4). Questa regione della colonna d’acqua (termoclino), oltre ad avere un gradiente di temperatura, ha anche un’intensità luminosa significativamente inferiore rispetto agli strati superficiali. Le abbondanze di picco del cyanobacterium Planctothrix rubescens adattato a bassa luminosità a circa 13 m di profondità nei profili estivi stratificati del lago di Zurigo coincidono con le abbondanze massime dell’SL56 (File aggiuntivo 1: Figura S3). Le celle SL56 sono a forma di bastoncello e allungate (lunghezza media = 0,68 ± 0,25 µm; larghezza media = 0,35 ± 0,09 µm; n = 6; Fig. 3 e). Per quanto ne sappiamo, questo è il primo rapporto di un gruppo di Cloroflexi specifico per l’acqua dolce che sembra prosperare nell’epilimnion.

Un totale di 14 MAG sono stati recuperati per il cluster SL56 (1 contenente 16S rRNA) e formano un lignaggio a livello di classe, considerevolmente divergente da tutti i Cloroflexi noti (Fig. 2). Il loro unico parente è un singolo MAG (Chloroflexi CSP1-4) descritto dal sedimento acquifero . Il clade 16S rRNA a cui il CSP1-4 si sarebbe affiliato è Gitt-GS-136 , e la maggior parte delle sequenze in questo clade provengono da sedimenti del suolo o del fiume (informazioni dalla tassonomia di SILVA). Tuttavia, non siamo stati in grado di rilevare alcuna sequenza rRNA 16S (parziale o completa) nella sequenza del genoma disponibile di CSP1-4. Il prossimo clade più vicino (nella tassonomia 16S rRNA) a Gitt-GS-136 e SL56 è KD4-96, le cui sequenze sono state ottenute dagli stessi habitat (vedere il file aggiuntivo 1: Figura S1B). Inoltre, tutte le sequenze note di rRNA 16S del gruppo SL56 provengono solo da acque dolci (Lago Gatun, Lago di Zurigo, ecc.). Nel loro insieme, sembra che i parenti filogenetici più vicini del lignaggio SL56 d’acqua dolce abitino gli habitat del suolo o dei sedimenti.

Le riviste SL56 sono state ricostruite da luoghi geograficamente distanti (Europa, Nord e Sud America, Fig. 2), e almeno nove specie diverse potrebbero essere rilevate (ANI, Fig. 1). Nessun MAGs sono stati ottenuti da campioni Lago Biwa, ma tre 16S sequenza rRNA sono stati recuperati in contigs unbinned. Le RIVISTE ricostruite sono distribuite globalmente lungo set di dati di acqua dolce da epilimnion (nessuno rilevato nell’ipolimnione profondo) (Fig. 4 e file aggiuntivo 1: Figura S6). Nessuna rivista SL56 è stata ricostruita dal Mar Caspio e nessuno dei genomi recuperati è stato reclutato da metagenomi salmastri. Proponiamo il genere candidato Limnocylindrus (Lim. no. cy. lin’drus.Gr. fem. s. limne un lago; L. masc. n. cylindrus a cylinder; N. L. masc. s. Limnocylindrus un cilindro da un lago) all’interno di Limnocylindraceae fam. ov., Limnocilindrales ord.nov., e Limnocilindria classis. ov. per il cluster Chloroflexi SL56.

Sequenze di rRNA TK10 16S sono state trovate alle più alte abbondanze nei campioni di ipolimnione del lago Biwa (massimo ca. 2%) (Fig. 1 bis, lettera c). Le cellule erano ovoidali con una lunghezza stimata di 1,08 ± 0,1 µm e una larghezza di 0,84 ± 0,09 µm (n = 12; Fig. 3 e). Un cluster coerente di nove RIVISTE (tre contenenti 16S rRNA File aggiuntivo 1: Figura S1) da luoghi geograficamente distanti (Europa, Asia e Nord America) è stato recuperato. Questi organismi straordinariamente cosmopoliti che prosperano negli strati più profondi del lago non sono molto diversi (valori ANI > 95%). Questa apparente bassa diversità potrebbe essere una conseguenza di una nicchia molto specializzata o ciò che è più probabile, un risultato di una transizione relativamente recente di acqua dolce, simile a “Ca. Fonsibacter ” (LD12 Alphaproteobacteria). Nessun rappresentante di rRNA 16S è stato rilevato con sicurezza nei metagenomi marini o salmastri sebbene alcune sequenze di rRNA 16S del database SILVA siano state ottenute da sedimenti marini e colonna d’acqua (File aggiuntivo 1: Figura S1). Parenti più stretti da 16S rRNA sembrano essere sia dal suolo o da campioni di sedimenti suggerendo che questi potrebbero essere il loro habitat originale. È interessante notare che il cluster TK10 è anche una ramificazione profonda, solo dopo SL56 e CSP1-4 nell’albero filogenetico di Chloroflexi in generale, e tutti gli altri rappresentanti di Chloroflexi (MAG o genomi isolati) sembrano discendere da un ramo distinto da entrambi questi. Suggeriamo il genere candidato Umbricyclops (Um.bri.cy ” clops. L. fem. N. umbra ombra; L. masc. s.ciclope (da Gr. Occhio rotondo; Ciclope) a ciclope; N. L. masc. s. Umbricyclops un occhio rotondo che vive all’ombra) all’interno di Umbricyclopaceae fam. ov., Umbricyclopales ord.nov., e Umbriciclopia classis novembre. per questo gruppo di organismi.

I risultati di CARD-FISH mostrano che le celle JG30-KF-CM66 sono sferiche con un diametro stimato di 0,56 µm (±0,15 µm; n = 8; Fig. 3e); tuttavia, proporzioni molto basse (< 0,28%) sono state osservate per JG30-KF-CM66 nel lago di Zurigo e nei profili di profondità del serbatoio Řimov (File aggiuntivo 1: Figure S3 e S4). Abbiamo ottenuto 12 RIVISTE, principalmente dalla colonna d’acqua profonda (otto salmastre, quattro d’acqua dolce), una con una sequenza quasi completa di 16, che ha formato un nuovo lignaggio a livello di classe nell’analisi filogenomica (Fig. 1). I parenti più stretti di queste riviste sono marine SAR202 e Dehalococcoidea (Fig. 1 e file aggiuntivo 1: Figura S1). All’interno di questo cluster, si possono distinguere gruppi distinti di RIVISTE salmastre e d’acqua dolce. Si consiglia il candidato genere Bathosphaera (Ba.tho.sphae’ra. Gr. adj. bathos deep; L. fem. s. sphaera a sphere; N. L. fem. s. Bathosphaera un batterio coccoide che vive in profondità) all’interno Bathosphaeraceae fam. ov., Bathosphaerales ord.nov., e Bathosphaeria classis. ov. per il cluster Chloroflexi JG30-KF-CM66.

Abbiamo anche recuperato RIVISTE nelle classi Chloroflexia (quattro RIVISTE) e Caldilineae (due RIVISTE) (Fig. 1). Chloroflexia MAGs erano correlati a mesophilic Oscillochloris trichoides DG-6 nel sottordine Chloroflexineae (un MAG) e altri tre MAGs a Kouleothrix aurantiaca nella Kouleotrichaceae fam. ov. formare un nuovo sottordine per il quale proponiamo il nome di sottordine Kouleothrichniae. ov. Nessuna di queste RIVISTE mostra alcun reclutamento frammento significativo a parte il loro luogo di origine. Altre 14 riviste provenienti dal Caspio affiliate al cluster SAR202 che non saranno ulteriormente discusse in questa sede in quanto sono già state descritte .

Apporto di acqua dolce Chloroflexi nel funzionamento dell’ecosistema

Metabolica intuizioni ricostruito Chloroflexi Riviste (completezza ≥ 30%) suggeriscono un principalmente degli eterotrofi stile di vita che in alcuni gruppi è potenziato da luce-driven per la generazione di energia tramite rhodopsins (CL500-11, Chloroflexales, SL56, e TK10) o aerobica anoxygenic phototrophy (Chloroflexales). Le RIVISTE di ciascun cluster contengono geni necessari per il metabolismo centrale dei carboidrati, tra cui glicolisi, gluconeogenesi e ciclo dell’acido tricarbossilico. Geni chiave per la riduzione del solfato assimilativo (3′-fosfoadenosina 5 ‘ – fosfosolfato (PAPS) sintasi e solfato adenililtransferasi) erano assenti nella maggior parte delle riviste che suggerivano l’utilizzo di composti esogeni a zolfo ridotto . Geni di denitrificazione (nitrato reduttasi / nitrito ossidoreduttasi alfa e beta subunità e nitrito reduttasi) sono stati trovati in riviste TK10, ma i successivi enzimi responsabili della produzione di azoto molecolare erano assenti.

In ambienti acquatici, Taumarchaeota e cianobatteri sono la principale fonte di cobalamina e dei suoi precursori corrinoidi per la grande comunità di auxotrofi o quei pochi in grado di salvare . La sintesi De novo di cobalamina ha un alto costo metabolico e l’ipotesi della Regina nera è stata avanzata come spiegazione per i motivi per cui solo pochi membri della comunità intraprendono la sua produzione . Nessuna delle riviste di Cloroflexi ricostruite codifica i geni necessari per la biosintesi dell’anello di corrina da zero, e anche i trasportatori di cobalamina ad alta affinità (BtuBFCD) o altri sospetti corrinoidi (DET1174-DET1176) mancavano, il che potrebbe essere una conseguenza dell’incompletezza del genoma o dell’uso di un trasportatore non descritto. Tuttavia, non tutti questi organismi sembrano essere auxotrophs poichè le riviste del mazzo JG30-KF-CM66 codificano i geni per cobinamide alla via di salvataggio della cobalamina che utilizza i corrinoidi importati insieme ai mediatori dalla via della biosintesi della riboflavina per sintetizzare la cobalamina . ZH-cloro-G3 MAG contiene un recupero quasi completo di cobalamina (manca solo CobC) e la via della biosintesi della riboflavina (file aggiuntivo 3: Tabella S2).

Geni di assemblaggio flagellare erano presenti in diverse RIVISTE di cluster CL500-11 e TK10 (Fig. 1 e file aggiuntivo 3: Tabella S2). Tuttavia, i componenti L-e P-ring che ancorano i flagelli alla membrana esterna mancavano in tutte le RIVISTE flagellate e fanno riferimento ai genomi di Cloroflexi (ad esempio, Thermomicrobium , Sphaerobacter ). Inoltre, i genomi MAGs e Chloroflexi di riferimento non codificano i geni per la biosintesi LPS e non sono stati rilevati sistemi di secrezione, a parte Sec e Tat (sono assenti i sistemi di secrezione di tipo I–IV ancorati nella membrana esterna) (File aggiuntivo 3: Tabella S2). Presi insieme, la genomica comparativa dei genomi di Cloroflexi disponibili rafforza le inferenze che, mentre i micrografi elettronici suggeriscono due strati densi di elettroni nella maggior parte dei membri di questo phylum, i Cloroflexi probabilmente possiedono una singola membrana lipidica (monoderma) piuttosto che due (didermi) .

Le sequenze simili alla rodopsina sono state riconosciute in 18 RIVISTE di questo studio da rappresentanti di CL500-11, Cloroflessia, SL56 e TK10 che sono filogeneticamente più vicini alle xanthorhodopsins (file aggiuntivo 1: Figura S8A e B), e sono sintonizzati per assorbire la luce verde simile ad altri rodopsini d’acqua dolce e costiera (File aggiuntivo 1: Figura S8C). Diverse RIVISTE codificano i geni per la biosintesi dei carotenoidi consentendo la possibilità di un’antenna carotenoide che è il segno distintivo delle xanthorhodopsins . Dei residui coinvolti nel legame con la salinixantina (il carotenoide predominante di Salinibacter ruber), abbiamo trovato un numero sorprendentemente elevato conservato (10 identici su 12 in almeno una sequenza di rodopsina) (File aggiuntivo 1: Figura S8D), suggerendo che un’antenna carotenoide può essere legata, rendendo almeno alcune di queste sequenze bonafide xanthorhodopsins.

Anche i rappresentanti di CL500-11 e TK10 che si trovano principalmente nell’ipolimnione durante la stratificazione sono in grado di fototrofia; tuttavia, possono potenzialmente accedere alla zona fotica durante l’inverno e all’inizio della primavera mixis. Oltre alla fotoeterotrofia a base di rodopsina, abbiamo anche recuperato RIVISTE della classe Cloroflessia che codifica i geni per le proteine del centro di reazione di tipo II fotosistema L e M (pufL e pufM), la batterioclorofilla e la biosintesi dei carotenoidi. Le sequenze geniche pufM si raggruppano insieme ad altre sequenze pufM correlate al Cloroflexi (File aggiuntivo 1: Figura S9). Tuttavia, nessuna prova per la fissazione del carbonio, tramite la via 3-idrossipropionato o il ciclo di Calvin-Benson è stata trovata in qualsiasi fotosistema con MAG che potrebbe essere una conseguenza dell’incompletezza del MAG. Può anche essere che questi sono fototrofi anossigenici aerobici che non fissano il carbonio, ad esempio, Gemmatimonadetes d’acqua dolce e Acidobatteri (entrambi aerobici) .

Storia evolutiva del Chloroflexi pelagico

È evidente dalle analisi filogenomiche che la raccolta di rappresentanti del phylum Chloroflexi recuperata in questo lavoro, insieme alle sequenze genomiche esistenti da isolati e riviste, offre solo uno schizzo parziale della complessa storia evolutiva del phylum in generale. Ad esempio, i rami più divergenti “Ca. Limnocilindria “(cluster SL56) e ” Ca. Umbricyclopia “(cluster TK10) non ha praticamente parenti stretti a parte un MAG di sedimenti acquiferi (relativo a ” Ca. Limnocilindria”). Tuttavia, i relativi cloni di rRNA 16S sono stati recuperati da suolo / sedimenti per entrambi questi gruppi, suggerendo transizioni a uno stile di vita pelagico (File aggiuntivo 1: Figura S1B).

Considerare l’assenza di sequenze marine 16S rRNA correlate per questi gruppi, oltre alla loro non rilevabilità nei set di dati metagenomici marini suggerisce anche un’ascendenza dal suolo/sedimento piuttosto che dall’ambiente salino. Sebbene la possibilità di un’origine marina non possa essere formalmente esclusa, la direzionalità di una transizione dal suolo/sedimento alle colonne di acqua dolce appare molto probabile. Inoltre, dato che ” Ca. Limnocilindria ” e ” Ca. Umbriciclopia “divergono prima della divergenza delle classi Dehalococcoidea e marine SAR202 (classe” Ca. Monstramaria”), che sono l’unico Cloroflexi marino ecologicamente rilevante conosciuto finora (il primo nei sedimenti marini e il secondo nella colonna d’acqua oceanica profonda), è probabile che il Cloroflexi ancestrale abbia avuto origine in un habitat suolo/sedimento. Il successo del SAR202 marino negli oceani profondi è notevole; è il gruppo Cloroflexi più diffuso, forse numericamente più abbondante del pianeta. Tuttavia, alcune sequenze di rRNA 16S dai suoi parenti più stretti, Dehalococcoidea, sono state recuperate anche da sedimenti d’acqua dolce, anche se la stragrande maggioranza sembra provenire da sedimenti marini profondi (entrambi habitat anossici).