fenduto-Caspase-3 anticorpo è un marker dell’attivazione di Caspase-9-come DRONC attività in Drosophila

Etichettatura da fenduto-Caspase-3 anticorpo persiste nel dcp-1 livelli doppi mutanti

Per valutare la specificità di fenduto-Caspase-3 anticorpo, abbiamo analizzato occhio immaginale dischi da terzo instar larve. Nei dischi imaginal dell’occhio wild-type, l’anticorpo rileva alcune cellule morenti sparse in tutto il disco (Figura 1a). Sorprendentemente, nei dischi oculari doppiamente mutanti per gli alleli nulli dcp-1Prev e drICEΔ1 (ref.14, 15), l’anticorpo scisso-Caspasi-3 etichetta ancora le cellule (Figura 1b). Etichettatura in dcp-1prev drICEΔ1 doppi mutanti si verifica in cluster (Figura 1b), simile a quanto osservato in precedenza quando la morte cellulare è stata bloccata dall’espressione di Caspasi-3 inibitore P35.3 Queste osservazioni suggerirebbero che l’anticorpo scisso-Caspasi-3 rileva ancora un epitopo in assenza delle proteine Caspasi-3-like DCP-1 e DRICE. Tuttavia, poiché l’apoptosi in questa fase non si verifica in un modello definito, eravamo incerti sulla specificità di questi segnali di etichettatura.

Pertanto, abbiamo usato transgeni GMR-hid,un modello apoptotico ben caratterizzato, 5 per esaminare ulteriormente la specificità dell’anticorpo scisso-Caspasi-3. Attraverso l’espressione guidata da GMR del gene pro-apoptotico nascosto specificamente nella metà posteriore dell’occhio in via di sviluppo, i transgeni GMR-hid inducono l’apoptosi in due onde distinte come mostrato dall’anticorpo cleaved-Caspase-3 e dall’etichetta tunel28 (Figura 1c,d). Per valutare la specificità dell’anticorpo scisso-Caspasi-3, abbiamo esaminato i dischi oculari GMR-hid che erano doppiamente mutanti per dcp-1Prev e drICEΔ1. In linea con le aspettative, la perdita di dcp-1Prev e drICEΔ1 abroga completamente l’apoptosi TUNEL-positiva nei dischi GMR-hid (Figura 1f). Sorprendentemente, tuttavia, i dischi oculari dcp-1Prev drICEΔ1 double mutant GMR-hid mostravano ancora una forte immunoreattività con anticorpo scisso-Caspasi-3 (Figura 1e). Pertanto, l’anticorpo scisso-Caspasi-3 non rileva o non solo DRICE e / o DCP-1. Notiamo, tuttavia, che l’aspetto dell’etichettatura dell’anticorpo scisso-Caspasi-3 cambia in assenza di DCP-1 e DRICE (confronta Figura 1c ed e). Il segnale di etichettatura non è più limitato a due onde distinte (Figura 1c), ma riempie l’intero compartimento posteriore del disco oculare ed è limitato alle cellule interommatidiali (Figura 1e). Un simile cambiamento del modello d’etichettatura è stato riferito per l’etichettatura dell’anticorpo CM1 sopra espressione dell’inibitore P35 di caspasi.3 Questo cambiamento del modello di etichettatura è probabilmente dovuto al fatto che le cellule nei dischi dcp-1prev drICEΔ1 double mutant GMR-hid eye non muoiono (Figura 1f) e quindi mantengono l’epitopo rilevato dall’anticorpo scisso-Caspasi-3. Tuttavia, è importante notare che questa analisi dimostra la rilevazione di un epitopo in assenza di proteine simili alla Caspasi DCP-1 e DRICE mediante anticorpo scisso-Caspasi-3.

L’immunoreattività dell’anticorpo cleaved-Caspase-3 dipende dai componenti dell’apoptosoma DRONC e ARK

Ci sono due possibilità per cui l’anticorpo cleaved-Caspase-3 etichetta le cellule mutanti doppie dcp-1 drICE, sebbene non siano apoptotiche. In primo luogo, l’anticorpo non può rilevare un epitopo apoptotico; o in secondo luogo, l’anticorpo può rilevare un epitopo apoptotico generato a monte o in parallelo a DCP-1 e DRICE. Per distinguere tra queste possibilità, abbiamo esaminato GMR-hid occhio dischi mutanti per i componenti apoptosoma DRONC e ARK, che agiscono a monte di DRICE e DCP-1. Nei dischi oculari dronc e ark mutant GMR-hid, le etichette degli anticorpi TUNEL e cleaved-Caspase-3 sono bloccate (Figura 1 g,h; Figura 3a,b). Questi dati confermano che l’anticorpo scisso-Caspasi-3 rileva effettivamente un epitopo apoptotico nella Drosophila. Inoltre, poiché non riesce a rilevare l’epitopo apoptotico nei mutanti dronc e ark, ma non nei doppi mutanti drICE dcp-1, è più accurato considerare l’anticorpo scisso-Caspasi-3 come marker per l’attività DRONC, piuttosto che l’attività caspasi effettrice, nelle cellule morenti di Drosophila.

Il tripeptide ETD è l’epitopo apoptotico rilevato dall’anticorpo cleaved-Caspase-3

L’epitopo rilevato dall’anticorpo cleaved-Caspase-3 dipende dall’attività del DRONC. Può essere possibile che l’anticorpo riconosca direttamente il DRONC attivato. In alternativa, è anche possibile che l’anticorpo cleaved-Caspase-3 rilevi un epitopo generato attraverso la scissione di un substrato sconosciuto da DRONC attivo, indipendentemente da DRICE e DCP-1.

Per distinguere tra queste due possibilità, abbiamo allineato i residui dalla cisteina catalitica (Cys163) al sito di scissione a Asp175 della Caspasi-3 umana (peptide Caspasi-3) con le regioni corrispondenti delle caspasi Drosophila (Figura 2a; vedi anche rif. 3). La maggior parte dei residui C-terminali del peptide Caspasi-3, ETD, sono conservati in DRICE e DCP-1 (Figura 2a). Simile a Caspase-3, questo è il sito di scissione per l’attivazione di almeno DRICE,29 e possibilmente DCP-1. È interessante notare che l’N-terminale, due terzi del peptide Caspasi-3, ha la massima somiglianza con DRONC; sei residui su nove sono conservati (Figura 2a). Questa parte del peptide Caspase-3 è meno ben conservata in DRICE, DCP-1 e nelle restanti Drosophila caspases. Sebbene la scissione tra le subunità grandi e piccole di DRONC non sia necessaria per la sua attività,30, 31 e potrebbe non verificarsi in vivo, abbiamo considerato la possibilità che gli anticorpi diretti contro la parte N-terminale del peptide Caspasi-3 possano rilevare direttamente il DRONC attivo nelle cellule morenti.

Abbiamo usato peptidi bloccanti per valutare quali epitopi del peptide Caspasi-3 sono rilevati dall’anticorpo scisso-Caspasi-3 nelle cellule di Drosophila morenti. Le sequenze dei peptidi bloccanti sono mostrate nella Figura 2b e sottolineate nella figura 2a. Il peptide bloccante A (TETD) deriva da DRICE e DCP-1 e il peptide bloccante B (CRGDEYDLG) corrisponde alla regione di massima somiglianza in DRONC (Figura 2a,b). Il peptide C è un peptide di controllo corrispondente ai residui immediatamente adiacenti al peptide B in DRONC (Figura 2a,b). Il peptide D è un altro peptide di controllo, che è molto simile al peptide A ed è derivato dal prodomain di DRONC alla posizione 113. Se il prodomain di DRONC è scisso in questo sito, esporrà ESD al suo C-terminale, che è molto simile al C-terminale del peptide Caspasi-3 (ETD, peptide A) e può, quindi, essere rilevato dall’anticorpo scisso-Caspasi-3.

I peptidi bloccanti sono stati miscelati con l’anticorpo scisso-Caspasi – 3 60 min prima dell’incubazione con i dischi immaginali oculari. I risultati degli esperimenti di blocco sono riassunti nella figura 2b e per i peptidi A e B mostrati nella Figura 2c-f. Il peptide A è sufficiente per bloccare l’intera immunoreattività dell’anticorpo scisso-Caspasi-3 in GMR-hid e in dcp-1 drICE double mutant GMR-hid eye discs (Figura 2c,d). Al contrario, il peptide B non abroga l’immunoreattività dell’anticorpo in questi dischi (Figura 2e,f). Anche i peptidi di controllo C e D non riescono a bloccare l’immunoreattività cleaved-Caspase-3 (Figura 2b; dati non mostrati).

Questi dati dimostrano che l’anticorpo scisso-Caspasi-3 rileva specificamente l’epitopo ETD nelle cellule apoptotiche. Tra le caspasi di Drosophila, questo epitopo è presente solo in DRICE e DCP-1, quindi è molto probabile che l’anticorpo rilevi effettivamente queste caspasi effettrici. Al contrario, il fatto che i peptidi derivati da DRONC B, C e D non riescano a bloccare l’immunoreattività suggerisce che è improbabile che l’anticorpo rilevi direttamente il DRONC attivo. Pertanto, poiché l’anticorpo scisso-Caspasi-3 non perde l’immunoreattività nei doppi mutanti dcp-1 drICE (Figura 1e), rileva almeno un’altra proteina, che espone l’epitopo ETD in modo DRONC-dipendente.

L’attivazione di DCP-1 indipendentemente da ARK ripristina l’immunoreattività clivata-Caspasi-3

L’analisi presentata in Figura 2 suggerisce, ma non dimostra, che l’anticorpo clivato-Caspasi-3 rileva effettivamente DCP-1 e DRICE clivati. Per testare direttamente questa possibilità, abbiamo espresso un transgene GMR-ΔN-dcp-1 in ark mutant background. ΔN-dcp-1 manca il prodomain N-terminale di DCP-1. Si pensa che ΔN-DCP-1 impoverito dal prodomain promuova prontamente l’autoprocessing e che un’espressione coerente sotto il controllo GMR induca un fenotipo di ablazione oculare.32 Questo fenotipo di ablazione oculare è causato dall’induzione dell’apoptosi (Figura 3c,d). Come accennato in precedenza, i cloni mutanti ark in background GMR-hid non riescono a indurre apoptosi TUNEL-positiva (Figura 3b) e l’anticorpo scisso-Caspasi-3 non ha alcuna immunoreattività nei cloni ark (Figura 3a) suggerendo che né DCP-1 né DRICE né i substrati sconosciuti di DRONC sono scissi nei cloni mutanti ark. Pertanto, abbiamo testato se l’espressione di ΔN-Dcp-1 in assenza di attività apoptosoma, cioè nei cloni ark, può ripristinare l’etichettatura degli anticorpi scissi-Caspasi-3. Rispetto al tessuto wild-type (contrassegnato da GFP nella Figura 3c, c’), il numero di cellule clivate-Caspasi-3 positive è fortemente ridotto nei cloni mutanti ark (Figura 3c, c’) suggerendo che l’attivazione di ΔN-DCP-1 è almeno parzialmente dipendente dall’apoptosoma. Tuttavia, circa il 50% dei cloni mutanti ark (n=32) nello sfondo GMR-ΔN-Dcp-1 contengono cellule immunoreattive scisse-Caspasi-3 (frecce in Figura 3c, c’). Questo è improbabile che sia un artefatto di etichettatura, perché queste cellule sono anche TUNEL-positivo (Figura 3d, d’). Pertanto, poiché il DRONC è inattivo nello sfondo mutante ark suggerendo che il segnale di etichettatura cleaved-Caspase-3 non è causato dal substrato sconosciuto di DRONC, questa analisi dimostra che l’anticorpo cleaved-Caspase-3 rileva effettivamente il DCP-1 cleaved. È anche possibile che l’anticorpo cleaved-Caspase-3 rilevi DRICE cleaved in questo esperimento, perché DCP-1 può processare proteoliticamente DRICE, almeno in vitro.29, 32 Un’analisi simile con DRICE non può essere effettuata perché GMR-drICE e GMR-ΔN-drICE non causano un fenotipo di ablazione oculare.32 Tuttavia, se DCP-1 fende DRICE in vivo o no, data la somiglianza di sequenza di DCP-1 e DRICE al C-terminale della grande subunità e il peptide bloccando i dati di Figura 2, suggerisce che l’anticorpo può anche rilevare DRICE scisso.