Cromosoma 20 eliminazioni nelle neoplasie mieloidi: riduzione di comune, regione eliminata, generazione di un PAC/BAC contig e l’identificazione di geni candidati

bandeggio Cromosomico e pittura

midollo Osseo cromosoma preparazioni di 107 casi con mieloide disturbi sono stati analizzati da G banding per valutare le dimensioni della delezione del braccio lungo del cromosoma 20. Come descritto in precedenza (Nacheva et al., 1995b), sono state identificate due categorie di delezione 20q: grandi delezioni (59 casi), con conseguente perdita di entrambe le bande scure Giemsa da 20q (Figura 1a, in alto) e piccole delezioni (48 casi) in cui rimane una banda scura Giemsa (Figura 1a, in basso). Successivamente ci siamo concentrati su quest’ultimo gruppo di pazienti (riassunto nella Tabella 1).

PESCE di analisi che utilizza un cromosoma 20 vernice è stata effettuata a 48 campioni con un piccolo 20q eliminazione. In sei casi, la ‘cancellazione 20q’ è stata rivelata essere dovuta a riarrangiamenti criptici. In un caso, l’applicazione simultanea di vernici per i cromosomi 15 e 20 ha identificato un marker derivato dal cromosoma 15 ma due normali omologhi del cromosoma 20 (Figura 1b). Nei restanti cinque casi, la pittura cromosomica ha dimostrato la presenza di una traslocazione sbilanciata con un punto di interruzione ricorrente a 20q11.2 e partner cromosomici variabili (Figura 1c). In tutti e cinque i casi, il marcatore der(20) era l’unico prodotto di traslocazione conservato nel genoma. Inoltre, la mappatura FISH ha mostrato che il punto di interruzione sul cromosoma 20 si era verificato in una regione prossimale a D20S107 e ha confermato la perdita del resto del braccio lungo del cromosoma 20 (dati non mostrati). Questi risultati saranno riportati in dettaglio altrove.

Nei restanti 42 casi, la pittura cromosomica era coerente con una piccola delezione interstiziale di 20q (Figura 1d). La maggior parte (33 casi) presentava una delezione di 20q come unica anomalia cariotipica. Nei restanti nove casi, la delezione 20q è stata accompagnata da varie aberrazioni cromosomiche aggiuntive (Tabella 1). Tutti i 42 casi con una piccola delezione di 20q sono stati sottoposti ad ulteriore mappatura dei PESCI con sonde locus specific.

Deletion mapping analysis

I 42 pazienti con piccole delezioni di 20q sono stati analizzati da FISH utilizzando un PAC centromerico (CEP20), un PAC che si ibridava con una regione distale di 20q (LSI 20q13) e un PAC che si ibridava all’interno del CDR (LSI D20S108). In ogni paziente, sono stati osservati segnali sia da LSI 20q13 che da CEP20 ma non da LSI D20S108 sul cromosoma 20 eliminato confermando la presenza di una delezione interstiziale (riassunta in Figura 3). Le metafasi di ciascun paziente sono state quindi ibridate con la mappatura PACs ai confini del noto MPD e MDS/AML CDRs-D20S107 che si trova al confine prossimale del CDR e D20S176 che si trova telomerico del confine distale del CDR (Bench et al., 1998a; Wang et al., 1998).

In 37 pazienti (25 con MDS o AML, 12 con MPD) entrambe le sonde non è riuscito a produrre un segnale sul eliminato cromosoma 20 dimostrando la presenza di ampie delezioni che non consentono di perfezionare i Cdr. Tali campioni non sono stati studiati ulteriormente. Tuttavia, in quattro pazienti con MDS (DB53, MH40, DB122 e DB214) e uno con MPD (JH41) una delle due sonde ha dato un segnale sul cromosoma 20 eliminato e questi campioni sono stati analizzati in modo più dettagliato.

Oltre ai 42 pazienti con piccole delezioni di 20q che sono stati analizzati da FISH utilizzando sonde locus-specific, altri sei pazienti con delezione di 20q (quattro con MDS, due con MPD), per i quali non erano disponibili metafasi midollari, sono stati analizzati utilizzando PCR microsatellite. Il DNA dei granulociti e delle cellule T purificati è stato analizzato utilizzando un ampio pannello di marcatori polimorfici che copriva i CDR MPD e MDS / AML (Tabella 2). Tutti e quattro i pazienti con MDS hanno avuto eliminazioni che si estendevano oltre i limiti del CDR pubblicato. Tuttavia, in uno dei due pazienti MPD (RB42), il confine centromerico della delezione ha ridotto considerevolmente il CDR MPD (Figura 2, Tabella 2).

Riduzione della regione eliminata comune nei pazienti con MDS/AML

L’analisi preliminare FISH ha identificato quattro pazienti con MDS con delezioni che hanno invaso il CDR MDS/AML. In ogni caso, la cancellazione 20q era presente in tutte le metafasi esaminate. In tre casi (DB53, DB214 e MH40), la cancellazione 20q era presente come unica anomalia. Nel paziente DB122, la delezione di 20q era l’unica anomalia originale con due subcloni contenenti trisomia 21 o trisomia 8 e trisomia 21 oltre alla delezione di 20q. Questi quattro casi sono stati studiati utilizzando ulteriori sonde locus specifiche al fine di accertare i confini di delezione.

Il confine prossimale del CDR MDS/AML è stato raffinato dai pazienti DB53, MH40 e DB122. Il confine prossimale della cancellazione in DB53 si trova tra D20S107 e WI-11538 (Figura 3), una distanza di circa 400 kb. Per il paziente MH40, un PAC contenente WI-11538 (dJ357E14) ha costantemente dato origine a un segnale ridotto coerente con la presenza del punto di interruzione della delezione prossimale all’interno di questo PAC (Figura 3). Inoltre, il confine prossimale della delezione nel paziente DB122 giaceva tra sts-R52161 e stSG25449 (Figura 1e,f), una distanza inferiore a 200 kb (Figure 3 e 4). Ciò rappresenta una grande raffinatezza del confine prossimale del CDR MDS / AML.

Il paziente DB214 ha permesso un notevole affinamento del confine distale del CDR MDS / AML. Il confine distale di questa cancellazione si trova tra WI-12515 e stSG40369 (Figura 1g,h), una distanza inferiore a 100 kb (Figure 3 e 4).

Questi dati riducono quindi considerevolmente il CDR MDS/AML in una regione compresa tra PAC dJ620E11, che contiene sts-R52161, e PAC dJ196H17 che contiene WI-12515 (Figure 3 e 4). Il clone batterico contig presentato di seguito dimostra che la dimensione fisica di questa regione è di circa 2,6 Mb.

Riduzione della regione deleted comune nei pazienti MPD

Nel paziente JH41 (diagnosi PV), il confine prossimale della delezione era stato precedentemente determinato dalla PCR microsatellite per trovarsi tra D20S438 e D20S107 (Bench et al., 1998a). PAC dJ155H19, che contiene D20S107 (Figura 4), ha costantemente dato origine a un segnale ridotto coerente con la presenza del punto di interruzione della cancellazione prossimale all’interno di questo PAC (Figura 3).

Granulociti e cellule T di altri due pazienti sono stati studiati utilizzando PCR microsatellite (Tabella 2). Un paziente con PV (RB42) ha dimostrato ritenzione di eterozigosità a D20S108 ma perdita a D20S858 (Figura 2, Tabella 2). Il punto di interruzione prossimale della delezione in questo paziente si trovava tra D20S108 e D20S858, una distanza inferiore a 200 kb (Figure 3 e 4).

Questi dati riducono notevolmente il CDR MPD che ora è affiancato da D20S108 (questo studio) e D20S481 (Wang et al., 1998). La dimensione fisica stimata di questa regione è 2.7 Mb, utilizzando i dati del clone batterico contig presentato di seguito. La regione di sovrapposizione tra i nuovi CDR MDS/AML e MPD ha definito un CDR combinato “mieloide” di 1,7 Mb (Figura 3).

Un clone batterico contig che copre le regioni eliminate comuni MPD e MDS/AML

Avevamo precedentemente costruito un contig YAC da 11 Mb di questa regione del cromosoma 20 (Bench et al., 1998a). Per produrre una mappa fisica più dettagliata, abbiamo ora costruito una mappa contigua basata su PAC e BAC. I cloni PAC e BAC sono stati identificati mediante ibridazione di STSS in librerie genomiche (Ioannou et al., 1994; Osoegawa et al., 1998). I cloni sono stati sovrapposti usando le impronte digitali di restrizione (Gregory et al., 1997) e mappatura dei contenuti STS che consente di raggruppare i cloni in contig. Per colmare contigs, nuove sonde STSs e DNA, sviluppate dalle estremità di contigs, sono state utilizzate per ulteriori screening della libreria. Nuovi PAC e BAC sono stati poi amalgamati in contig allo stesso modo fino a quando non è stata prodotta una mappa contigua.

Il clone batterico contig contiene un totale di 456 cloni batterici di cui 376 PACs e 80 BACs. Si estende da D20S607 a SEMG1 e comprende 202 marcatori di DNA di cui 185 sono STSS e 17 sono sonde di DNA. La dimensione del contig era basata su una media di 3,5 kb per banda di impronte digitali HindIII (P Deloukas (2000), risultati non pubblicati). La dimensione stimata del contig è stata calcolata come 5 Mb moltiplicando il numero totale di diverse bande di impronte digitali all’interno del contig per 3,5. Una rappresentazione della mappa che illustra il percorso minimo di piastrellatura e PACS che sono stati utilizzati per esperimenti sui pesci è mostrato in Figura 4. Una versione completa della mappa può essere trovata ahttp://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/ace/pic/20ace?name=Chr_-20ctg125 & class = Map.

Identificazione di sequenze espresse

Quarantatré EST unici sono stati localizzati tra D20S607 e stSG34035 incluso. Di questi, 34 EST sono stati mappati mediante ibridazione su una “poligride” di PACs e BACs o mediante PCR di colonie batteriche contenenti PACs o BACs (Figura 4). Altri nove EST, precedentemente mappati in questa regione del cromosoma 20 (Bench et al., 1998a; Deloukas et al., 1998) sono stati posizionati sul contig mediante allineamento BLAST della sequenza EST con la sequenza genomica PAC o BAC disponibile.

Al fine di identificare sequenze espresse di novel putative, 23 cloni PAC dal percorso di piastrellatura minimo sono stati parzialmente o completamente sequenziati. La sequenza genomica di questi cloni è stata analizzata utilizzando il programma NIX (Williams et al., 1998) che consente l’osservazione simultanea di una serie di strumenti di identificazione genica tra cui GRAAL, GENSCAN e BLAST. Sono stati identificati otto EST e geni precedentemente non mappati (Tabella 3). Sei di questi giacevano all’interno del CDR MPD e sette giacevano all’interno del CDR MDS. È stata ottenuta la prova che sei di queste otto sequenze espresse putative rappresentavano geni trascritti in buona fede, piuttosto che pseudogeni elaborati o contaminanti del DNA genomico all’interno del database EST. KCNS1 è un gene che codifica una subunità del canale voltaggio-gated del potassio. ESTs AA053206/AA053121 sono stati successivamente trovati derivati dal gene SGK2 (Kobayashi et al., 1999). L’allineamento della sequenza cDNA alla sequenza genomica ha dimostrato una struttura esone / introne per tre dei restanti sei EST (AI312497, AA568401 e AA910031) con la sequenza di consenso del sito di giunzione presente in tutti i confini esone/introne. In tutti e tre questi casi, la presenza di ciascun esone è stata confermata da programmi di predizione degli esoni come il GRAAL. L’esistenza di un esone è stata prevista anche da GRAAL, GENSCAN e Genefinder all’interno della regione di PAC dJ1108D11 che allineato a EST AA993161 il che implica che questo EST rappresentava anche un gene trascritto.

L’analisi delle sequenze di PACS dall’interno del percorso minimo di piastrellatura ci ha anche permesso di stabilire la struttura genomica di geni noti e nuovi in questa regione. L’allineamento di RPTPrho cDNA ai PAC dJ1121H13, dJ707K17, dJ81G23, dJ230I19, dJ3E5, dJ232N11 e dJ269M15 ha dimostrato che questo gene si estende per almeno 1,2 Mb. PAC dJ138B7 conteneva due geni (h-l (3) mbt e SGK2) così come la porzione 5′ del gene corrispondente a SHGC-36858. In particolare, il gene h-l(3)mbt contiene 20 esoni con due esoni finali alternativi putativi. L’analisi di dJ644L1 ha dimostrato che il gene MafB umano è costituito da un singolo esone. L’analisi della sequenza finita è stata eseguita anche dal Centro Sanger (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Humana) e questo può essere visualizzato su http://webace.sanger.ac.uk/cgi-bin/webace?db=acedb20&class=GenomeSequence.

Questi dati stabiliscono la presenza di sei geni e di altri 14 EST unqiue all’interno del nuovo CDR MDS/AML e un totale di 14 geni con 23 EST unici all’interno del nuovo CDR MPD (Tabella 3). Sei geni e 10 EST unici sono presenti nella regione di sovrapposizione tra i due CDR.

Expression profiling

Si ritiene che le patologie mieloproliferative, le sindromi mielodisplastiche e la leucemia mieloide acuta derivino dalla trasformazione di una cellula multipotente all’interno del compartimento delle cellule staminali ematopoietiche (Bonnet e Dick, 1997; Kralovics e Prchal, 1998). Inoltre, è stato precedentemente dimostrato che la delezione 20q può insorgere in una cellula progenitrice in grado di dare origine sia alle cellule mieloidi che alle cellule B (White et al., 1994). Queste considerazioni suggeriscono che il gene o i geni sul cromosoma 20q che sono inattivati in queste malattie sono probabilmente espressi in normali cellule progenitrici ematopoietiche. Abbiamo quindi determinato quali delle sequenze trascritte sono state espresse nel midollo osseo e nelle cellule CD34 positive purificate.

L’amplificazione Reverse transcription PCR (RT–PCR) è stata eseguita con primer che rappresentano ciascuna delle 51 sequenze trascritte (Figura 5). Sono state eseguite almeno due amplificazioni RT–PCR indipendenti per ciascuna sequenza trascritta. I primer corrispondenti a un EST (WI-7685) derivato dal 3′ UTR del gene CD34 sono stati utilizzati come controllo positivo (Figura 5). Dove due o più EST corrispondevano alla stessa sequenza trascritta, lo stesso risultato è stato ottenuto per ogni EST.

I dati sono presentati nella figura 5, tabelle 3 e 4. Delle 37 sequenze espresse nel CDR MPD, 20 sono state espresse in cellule mononucleate del midollo osseo. Di questi, 16 sono stati espressi anche in cellule CD34 positive. All’interno del CDR MDS/AML, 11 sequenze trascritte su 20 sono state espresse in cellule mononucleate del midollo osseo. Di questi, otto sono stati espressi anche in cellule CD34 positive. Delle 16 sequenze trascritte che si trovano nella regione di sovrapposizione tra MPD e MDS/AML CDR, otto sono state espresse in cellule del midollo osseo di cui cinque sono state espresse anche in cellule CD34 positive. Queste cinque sequenze trascritte rappresentano quindi i geni candidati principali poiché si trovano sia all’interno del CDR MPD che MDS / AML e sono espressi all’interno del compartimento cellulare progenitore ematopoietico. Essi comprendono due geni sconosciuti corrispondenti a ESTS SHGC-36858 e WI-12515 così come tre geni, SFRS6, h-l(3)mbt e MYBL2.