Come eseguire l’estrazione del DNA da macchie di sangue essiccate Utilizzando la resina Chelex

Ogni bio – scienziato che vuole analizzare il DNA sa che il processo inizia con l’estrazione del DNA dalle cellule di interesse. Queste cellule potrebbero essere globuli rossi, parassiti o batteri per citarne alcuni. Inoltre, ci sono vari metodi di estrazione del DNA 1 tra cui scegliere a seconda del tipo di campione, dell’analisi a valle e così via. Molti scienziati iniziano con macchie di sangue essiccate (DBS) e quindi come estrarre il DNA da tali campioni è di particolare interesse. Un DBS è comunemente preparato, raccogliendo sangue su una carta da filtro cromatografica da 3 mm Whatman FTA card2 o Whatman e lasciandolo asciugare per un periodo di tempo (~4 ore) prima dell’elaborazione. Questo metodo di campionamento biologico è stato utilizzato per decenni.

Un metodo utile per isolare il DNA da tali campioni utilizzando BT Chelex 100 Resin3 è descritto di seguito.

Fase uno: Lisi degli eritrociti

• Tagliare una macchia di sangue secca e inserirla in un tubo di microcentrifuga (1,5 ml) utilizzando un perforatore. Non dimenticare di etichettare il tubo, soprattutto quando si lavora su più campioni. Per scopi di controllo della qualità, includere anche un punto di sangue di controllo positivo.
• Aggiungere 1 ml di saponina allo 0,5% nella provetta per microcentrifuga contenente la macchia di sangue. Chiudere, vorticare e incubare a 4 0C per almeno 4 ore, o meglio ancora, durante la notte. In questa fase, saponina complessi con colesterolo nella membrana eritrocitaria che porta alla formazione di pori nella membrana e quindi emolisi.4 La saponina è un reagente di lisi comunemente usato per liberare i parassiti (ad esempio i parassiti della malaria) dai globuli rossi.
• Girare per alcuni secondi a 4.000 giri / min, per rimuovere le gocce dal coperchio interno, e aspirare la saponina dal tubo utilizzando una punta di pipetta non barriera collegata a una pipetta pasteur su una macchina di assemblaggio sottovuoto. È anche possibile utilizzare una pipetta pasteur in plastica. Lasciare il punto nel tubo di microcentrifuga.

Fase due: Lavaggio

• Aggiungere 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato nel microcentrifugo, chiudere, vortex e incubare a 4 0C per 20-30 minuti. L’incubazione durante la notte non causerà alcun danno. Questo passaggio assicura che la saponina venga rimossa dal tubo.
• Girare per alcuni secondi a 4.000 giri / min, quindi rimuovere il PBS, nello stesso modo in cui è stata rimossa la saponina. Lasciare il punto nel tubo di microcentrifuga.

Fase tre: Estrazione del DNA con resina Chelex

Principio: La resina Chelex agisce impedendo la degradazione del DNA da enzimi degradativi (DNasi) e da potenziali contaminanti che potrebbero inibire le analisi a valle. In generale, la resina Chelex intrappolerà tali contaminanti, lasciando il DNA in soluzione. La resina Chelex arresta cationi come Mg2+, un importante co-fattore per l’azione della DNasi, proteggendo così il DNA dalla degradazione.5,6

• Pipettare e aggiungere 150µL di soluzione di resina Chelex al 6,7% nella provetta per microcentrifuga contenente il punto. Chiudi il tubo. Un importante promemoria: quando si prepara la soluzione di Chelex al 6,7%, utilizzare acqua priva di DNasi, nucleasi (o qualsiasi cosa che possa danneggiare e degradare il DNA).
• Incubare a 95 0C per 10 minuti utilizzando un blocco di calore / agitatore. È importante aprire il tubo due volte, ogni 2 minuti, per rilasciare la pressione e quindi agitare per alcuni secondi successivamente. Questo rilascia il DNA in soluzione.

Fase quattro: Evitare le perle di resina Chelex nell’estratto finale

• Girare per 5 minuti a 4.000 giri / min
• Pipettare quanto più estratto possibile in un tubo di microcentrifuga più piccolo (0,6 ml) utilizzando una punta di barriera aerosol evitando il trasferimento delle perle Chelex.
• Centrifugare la microcentrifuga da 0,6 ml a 4.000 giri / min per 10 minuti. L’idea del secondo giro è di rimuovere tutte le perle rimanenti del Chelex che potrebbero portare sopra nell’estratto finale. Perché questo è importante? Due ragioni principali: 1) Chelex si lega agli ioni di magnesio (cofattore essenziale per la Taq polimerasi utilizzata nella PCR) e 2) Chelex fluoresces. Se la fluorescenza è il tuo modo di visualizzare un risultato, questo potrebbe creare un falso positivo.
• Pipettare circa 100 µL e trasferire l’estratto finale in un nuovo microcentrifugo. Etichetta e conservare in frigorifero.

Alcuni Suggerimenti Mentre si Fa il DNA Estrazioni

• Lavorare in un ambiente pulito, privo di contaminanti
• Utilizzare puntali che sono liberi di nucleasi
• Gestire tutti i campioni con i guanti
• Ancora una volta, evitare Chelex perline in finale estratto

Conclusione

Chelex resin7, fornisce un semplice, e rapido metodo di estrazione del DNA da DBS, per l’uso in vari molecolare applicazioni analitiche. Questo metodo non richiede attrezzature costose ed è affidabile se testato contro altri metodi.

1. GE Healthcare (2010). Estrazione affidabile del DNA dalle carte Whatman FTA. Nota applicativa 28-9822-22 AA. Buckinghmashire, Regno Unito: GE Healthcare.
2. Whatman (n. d.). Preparazione di un disco FTA per l’analisi del DNA. Whatman Protocollo FTA BD08.
3. Bio-Rad (n.d.) Chelex® 100 e Chelex 20 Resina chelante a scambio ionico Manuale di istruzioni. LIT200RevB. Hercules, CA: Laboratori Bio-Rad.
4. Baumann, E., Stoya, G., Völkner, A., Richter, W., Lemke, C. e Linss, W. (2000). L’emolisi degli eritrociti umani con saponina influisce sulla struttura della membrana. Acta Histochemica, 102(1), 21-35.
5. IBRC (2016). Protocollo di estrazione: Chelex. Sito web IBRC. Nel 2007, il gruppo ha pubblicato il suo primo album in studio,””. Sviluppo e validazione interna di un protocollo di estrazione del DNA Chelex ® per tamponi orali di riferimento.
6. Walsh, PS, Metzger, DA, e Higuchi,R. (2013). BioTechniques 30th Anniversary Gem Chelex 100 come mezzo per una semplice estrazione di DNA per la tipizzazione basata su PCR da materiale forense. Biotechniques, 54(3), 134-139.