La microscopia di default è una tecnica che ci permette di osservare, piuttosto che misurare, eventi biologici e trarre conclusioni basate su ciò che vediamo, piuttosto che sulla base di alcuni calcoli. L’argomento di questo articolo può quindi sembrare un po ‘ sorprendente dal momento che si occupa delle misure di colocalizzazione. Mentre ci sono situazioni in cui è possibile determinare visivamente la colocalizzazione delle proteine, spesso sarà necessaria una conferma più accurata di una distribuzione reciproca di due sonde.
Perché una determinazione visiva della colocalizzazione è insufficiente?
Solo se hai raccolto immagini seguendo un protocollo controllato per l’analisi di colocalizzazione (segnale sufficiente in ogni canale, nessuna autofluorescenza o bleed-through del segnale) è sicuro dire che le due sonde colocalizzano esclusivamente in base all’osservazione. In questo caso, se il segnale verde si colocalizza con il segnale rosso e l’immagine è per lo più gialla, non è necessaria alcuna misurazione statistica. Ma se non vedi una sovrapposizione, non significa che non ci sia! Può essere che le intensità dei due canali non siano le stesse. Vale a dire, il colore intermedio che vediamo può apparire solo se entrambe le sonde hanno la stessa intensità. Pertanto le conclusioni basate sulla determinazione visiva possono spesso portare a risultati falsi negativi.
Quali metodi esistono per la misurazione della sovrapposizione?
Mentre non esiste un approccio standard a questa materia, ci sono due metodi che sono ampiamente utilizzati e generalmente accettati. Questi coinvolgono il coefficiente di correlazione di Pearson (PCC) o il coefficiente di colocalizzazione di Mander (MCC).
Questi due metodi si riferiscono a due diversi aspetti della colocalizzazione: correlazione e co – occorrenza. Il coefficiente di Pearson è correlato alla correlazione delle intensità dei pixel nei due canali. Misura la relazione tra i segnali-se i valori del segnale in un canale aumentano simultaneamente con l’altro, o un segnale cade quando l’altro sale. La correlazione è distinta dalla co-occorrenza, che è espressa matematicamente attraverso il coefficiente di Mander. Questo rappresenta la copertura di un segnale rispetto all’altro, che rivela la misura in cui due sonde occupano lo stesso posto. Esploriamo questo un po ‘ più lontano.
Coefficiente di correlazione di Pearson (PCC)
Definizione: PCC riflette la relazione lineare tra intensità del segnale. I valori possono variare tra 1 (perfetta correlazione positiva) e -1 (perfetta correlazione negativa), mentre 0 significa che non esiste alcuna correlazione. È possibile esplorare visivamente il PCC attraverso uno scattergram in cui le coordinate sul grafico rappresentano valori di pixel (segnale) in entrambi i canali. Più punti si raggruppano attorno a una linea retta, migliore è la correlazione tra i due segnali
Requisiti: il PCC deve essere misurato nella regione di interesse (ROI) per evitare falsi positivi o negativi. Se si misura il PCC sull’intera immagine, i pixel dello sfondo si correlano perfettamente e gonfiano il PCC. Al contrario, se la misurazione viene eseguita in una regione di nessun interesse in cui vi è una distribuzione eterogenea di entrambi i canali, il PCC sarà depresso.
È possibile selezionare il ROI manualmente o mediante soglia per escludere lo sfondo. Qualunque sia il modo in cui lo si fa, fare attenzione, soprattutto quando soglia. La selezione del ROI deve includere tutte le regioni rilevanti della cella(s) cioè, ogni luogo in cui una sonda può essere previsto per distribuire. Se si utilizza un metodo basato sull’intensità per selezionare il ROI( soglia), è possibile escludere inavvertitamente i risultati rilevanti. Come può accadere? Si potrebbe avere una regione di esclusione reciproca, dove non appare nessuna etichetta, e questo può essere un risultato biologicamente rilevante (entrambe le molecole non sono espresse in quel punto della cellula). Tuttavia, thresholoding non includerà questa regione nel ROI, mettendoti in pericolo di perdere risultati rilevanti.
Consigliato per: PCC dovrebbe essere usato sulle immagini se esiste una relazione lineare tra intensità. Se i dati si adattano a un modello più complesso, PCC non funzionerà bene. Un metodo diverso dovrebbe essere scelto anche se c’è una sovrapposizione irregolare, dove le sonde co-distribuiscono ma in proporzioni diverse. Ciò può verificarsi quando GFP viene utilizzato come una sonda. Il suo livello di espressione può differire tra le cellule e potenzialmente causare depressione del PCC a causa dell’elevata variabilità intercellulare.
Coefficienti di colocalizzazione di Mander
Definizione: MCC è una metrica che descrive la co-occorrenza – la frazione di una proteina che colocalizza con l’altra. MCC ti darà una buona misura di colocalizzazione quando etichetti una proteina in una vescicola e vuoi vedere come si colocalizza con una certa struttura in una cellula, ad esempio un microtubulo. Se assumiamo che tutte le vescicole colocalizzino con microtubuli ma solo una proporzione di microtubuli colocalizza con la vescicola, è possibile calcolare MCC per ciascun canale e ottenere una metrica che descrive quantitativamente questa sovrapposizione frazionaria.
Requisiti: La cattura con MCC è che richiede l’eliminazione dello sfondo. La parte più difficile qui sta impostando un punto di taglio per l’intensità che abiliterà la sottrazione dello sfondo. MCC misura la fluorescenza completa di una sonda in ogni pixel sopra lo zero. Tuttavia, sopra lo zero pixel sono estremamente rari, a causa di fattori quali: autofluorescenza, perdita di luce, etichettatura non specifica o fluorescenza da pianure di immagini fuori fuoco. La misurazione di MCC richiede quindi un’attenta selezione della soglia (cutoff).
Il primo modo per farlo è la soglia globale, in cui si sottrae un valore di soglia da ciascun pixel, in modo che ogni livello al di sotto del limite selezionato sia sfondo e ogni pixel sopra cada in una regione di interesse. Mentre questo è molto intuitivo, la soglia globale è piuttosto grezza e può portare a situazioni indesiderate come l’esclusione dei pixel di basso valore che sono vicini allo sfondo ma sono in realtà positivi.
Un’opzione più automatica e meno soggettiva è il metodo Costes in cui la soglia viene stimata calcolando PCC più volte. Questo serve a definire l’intervallo di valori di pixel che sono positivi e quindi non dovrebbero essere esclusi. PCC viene calcolato per diversi gruppi di pixel e i valori di pixel per i quali PCC è uguale o vicino a zero vengono presi come valori di soglia. Tuttavia, dovrebbe anche essere controllato visivamente, poiché nelle immagini con un rapporto segnale-rumore inferiore può identificare un livello di soglia molto basso in modo che non distingua le strutture etichettate dallo sfondo.
Raccomandato per: Quando la questione biologica del tuo esperimento riguarda la misura in cui proteine/strutture si sovrappongono, MCC dovrebbe essere la misura della scelta. Questi coefficienti sono interpretati in modo più intuitivo rispetto al PCC e sono indipendenti dalla proporzionalità del segnale (le differenze nel numero di strutture etichettate da ciascuna sonda).
Prima di iniziare l’analisi
Qualunque sia la scelta per misurare la colocalizzazione, è molto importante che la raccolta di immagini venga eseguita in modo corretto. Cerca di controllare il maggior numero possibile di fattori e prepara una serie di campioni di controllo che ti consentono di monitorare il maggior numero possibile di variabili.
Tieni presente che la determinazione della colocalizzazione visiva è influenzata da molti fattori, tra cui la soggettività dell’osservatore, il fatto che il cervello di ogni individuo può vedere i colori in modo diverso, un possibile daltonismo dell’osservatore e la risoluzione spaziale che determina la dimensione dei pixel, tra gli altri. Assicurati di elaborare le immagini che stai per analizzare in modo uniforme e tieni presente che qualsiasi manipolazione incontrollata potrebbe farti perdere informazioni rilevanti.
E Ultimo ma non meno importante
Questi calcoli sono implementati nella maggior parte dei pacchetti software di analisi delle immagini, ad esempio ImageJ e Volocity. Ma, dato che misurare la colocalizzazione è ancora un campo un po ‘ confuso, sono necessari miglioramenti, quindi tieni traccia delle nuove versioni e dei pacchetti per il software.
Come si misura la colocalizzazione? Fateci sapere scrivendo nella sezione commenti!
Letteratura:
Dunn KW, Kamocka MM, McDonald JH. Una guida pratica per valutare la colocalizzazione in microscopia biologica. American Journal of Physiology-Cell Physiology (2011), 300 (4) C723-C742
Adler, Jeremy, Parmryd, Ingela: Analisi di colocalizzazione in microscopia a fluorescenza. In: Taatjes, Douglas J., Roth, Jürgen (ed.), Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols, New York: Humana Press, 2012, pp. 97-109
Mcdonald JH, Dunn KW. Test statistici per misure di colocalizzazione in microscopia biologica. Rivista di microscopia. 2013; 252(3): 295-302
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