Clonale ematopoiesi in pazienti con anti-citoplasma dei neutrofili anticorpo associata a vasculite| Haematologica

Clonale ematopoiesi indeterminato di potenziale (CHIP), definita dalla presenza di un somatiche ematologici associati al cancro mutazione del gene con una frequenza allele variante di ≥2% – si verifica nel sangue periferico di almeno il 10% degli individui di età superiore a 60 anni di età senza alcuna storia di un ematologiche disturbo.Le mutazioni di 21 colpiscono principalmente i regolatori epigenetici della trascrizione DNMT3A, TET2 e ASXL1, portando ad un vantaggio competitivo delle cellule staminali ematopoietiche mutate con un successivo bias di differenziazione verso il compartimento mieloide.43 La frequenza del CHIP aumenta con l’età e si associa a un rischio più elevato di sviluppare neoplasie ematologiche e malattie cardiovascolari, portando ad un aumento della mortalità complessiva.5

Utilizzando un modello murino con macrofagi Tet2-carenti, è stato dimostrato che l’aterosclerosi e la malattia coronarica sono guidate da CHIP attraverso una funzione infiammasoma alterata, portando ad un aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie.6 Il nostro gruppo ha recentemente rilevato una correlazione tra le mutazioni di DNMT3A e la malattia cronica del trapianto contro l’ospite, fornendo ulteriori prove di un ruolo importante del CHIP nelle reazioni infiammatorie croniche.7 Tuttavia, poco si sa sul ruolo del CHIP nelle malattie autoimmuni. Uno studio condotto su 56 pazienti affetti da artrite reumatoide non ha mostrato alcuna correlazione del CHIP con l’attività della malattia.8 Anticorpi citoplasmatici anti-neutrofili (ANCA) – vasculitidi autoimmuni associati (AAV) comprendono una varietà di vasculitidi necrotizzanti, tra cui granulomatosi con poliangiite e poliangiite microscopica, e sono caratterizzati da grave infiammazione dei piccoli vasi, che potenzialmente interessano ogni sistema di organi. ANCA sono diretti contro gli autoantigeni mieloperossidasi (MPO) e proteinasi 3 (PR3). Legandosi ai loro antigeni espressi dalla superficie cellulare, ANCA IgG provoca l’attivazione incontrollata di neutrofili e monociti, portando a danni endoteliali e insufficienza dell’organo finale. Nella maggior parte degli individui, il più alto carico di mutazione del CHIP può essere trovato nelle cellule mieloidi,4 che sono le uniche cellule responder primarie che esprimono autoantigene in AAV. Inoltre, TET2 e DNMT3A svolgono un ruolo centrale nel silenziamento genico regolando la metilazione del DNA. In effetti, è stato riportato un silenziamento genico difettoso nelle cellule mieloidi dei pazienti con AAV. Questo processo disregolato includeva gli autoantigeni ANCA e correlato al rischio di recidiva.119

In sintesi, dati recenti supportano l’idea di potenziali collegamenti, per quanto riguarda la patogenesi e gli esiti clinici, tra CHIP e malattie autoimmuni/condizioni infiammatorie. Abbiamo quindi caratterizzato CHIP in una grande coorte di pazienti con AAV, esaminando la prevalenza, i cambiamenti dinamici nel tempo, le manifestazioni di organi, il silenziamento dell’antigene ANCA e l’attivazione in vitro indotta da ANCA.

Abbiamo raccolto campioni di sangue periferico da pazienti con AAV, visti presso i reparti ambulatoriali e i reparti di nefrologia Charité/HELIOS (Berlino, Germania, tra aprile 2005 e ottobre 2018. I dati demografici e clinici dei pazienti sono stati estratti dalle loro cartelle cliniche. Tutti i pazienti hanno dato il loro consenso informato scritto all’inclusione nello studio, che è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. L’approvazione etica è stata ottenuta dai comitati etici locali.

Il DNA del sangue intero è stato sottoposto a screening per il CHIP utilizzando una versione personalizzata del pannello di sequenziamento mieloide Illumina TruSight (tabella supplementare online S1) su un sequencer NextSeq. L’analisi del sequenziamento è stata eseguita utilizzando un HUB di sequenziamento della piattaforma Illumina BaseSpace. Sono state incluse solo varianti nonsynonymous con frequenze alleliche ≥2%. Le varianti candidate sono state convalidate mediante sequenziamento profondo mirato (metodi supplementari online). Un totale di 46 mutazioni somatiche sono state identificate in 34 su 112 pazienti AAV (30,4%) con una frequenza mediana di allele variante di 5.2% (Tabella supplementare online S2). Mentre 25 pazienti avevano una singola mutazione, otto ne avevano due e un paziente ne aveva cinque. I geni mutati più frequentemente erano DNMT3A (19/46=39,1%), TET2 (7/46=15,2%) e ASXL1 (4/46=8,7%) (Figura 1A). Tra le 46 mutazioni, 26 erano missense, 18 erano troncanti e due erano mutazioni del sito di giunzione. La variazione di base più frequente nelle mutazioni missense è stata C > T (16/30) (Figura supplementare online S1).

Rispetto alle prevalenze precedentemente riportate di CHIP in coorti di controllo non selezionate di età e tecnologia di sequenziamento simili,15128743 la prevalenza di CHIP nei pazienti con AAV era significativamente più alta (30,4% vs. 13,5%, P<0,001) (Figura 1C, Tabella supplementare online S3). Tenendo conto delle diverse tecnologie di sequenziamento utilizzate in questi studi, abbiamo studiato una coorte di controllo di età e sesso corrispondente di 112 individui sani, tra i quali 22 mutazioni sono state trovate in 20 soggetti (controlli sani vs. pazienti AAV: 17.9% vs. 30.4%, P=0.042) (Tabella supplementare online S4, Cifre supplementari online S2-S4). Da notare, abbiamo trovato una percentuale rilevante di pazienti AAV con CHIP di età ≤55 anni (6/33=18,2%) (Figura 1B). Sono stati disponibili campioni di sangue periferico di follow-up per 19 pazienti con CHIP AAV. Il follow-up mediano è stato di 2,3 anni (intervallo 0,3-10,9 anni). Il carico mutazionale di campioni seriali di questi 19 pazienti a due o quattro punti temporali è stato quantificato mediante sequenziamento profondo.171674 Mentre cinque pazienti hanno mostrato un aumento rilevante della dimensione dei cloni, due pazienti hanno avuto cloni leggermente decrescenti e 12 pazienti non hanno mostrato alcuna variazione della dimensione dei cloni nel tempo (Figura 1D, Figura supplementare online S5). Successivamente, abbiamo studiato un campione di follow-up da ciascuno dei pazienti con CHIP 20, raccolti da 2 a 10 anni dopo il campione iniziale. Nessuno dei 20 campioni di follow-up ha mostrato una nuova mutazione.

Sono state eseguite analisi statistiche esplorative per identificare associazioni tra CHIP e parametri clinici (76 pazienti con granulomatosi con poliangiite e 34 con poliangiite microscopica). I pazienti con CHIP erano significativamente più anziani dei pazienti con CHIP (mediana 70,5 vs. 63,0 anni, rispettivamente, P = 0,017). La prevalenza del CHIP non era più alta tra i pazienti che avevano ricevuto un trattamento immunosoppressivo prima del campionamento (100% steroidi, 90% ciclofosfamide, 20% rituximab, 16% azatioprina, 13% metotrexato). Non sono state osservate differenze nella conta ematica, nell’ampiezza della distribuzione degli eritrociti, nei livelli di creatinina, nelle comorbidità, nello sviluppo di neoplasie maligne, nello stato di attività della malattia e nel rischio di recidiva di AAV rispetto allo stato del CHIP. Tuttavia, i modelli di manifestazione della malattia differivano: i pazienti con CHIP affetti da granulomatosi con poliangiite mostravano meno malattia renale (68,2% vs. 88,5%, P=0,049) e coinvolgimento del sistema nervoso (0% vs. 19,2%, P=0,028) (Tabelle supplementari online S5-S8, figure supplementari online S6-S8).

Successivamente, abbiamo mirato a studiare il silenziamento dell’antigene ANCA e l’attivazione in vitro indotta da ANCA. A tal fine, sono stati eseguiti saggi di stimolazione dei neutrofili in vitro utilizzando ossidazione diidrorodamina con anticorpi monoclonali contro gli antigeni ANCA MPO e PR3 in un sottoinsieme di pazienti AAV e controlli sani (metodi supplementari online) che erano risultati negativi per il CHIP. Un’attivazione ridotta è stata osservata nei pazienti con CHIP rispetto ai pazienti con CHIP AAV (anti-MPO: indice di stimolazione: 6,29 vs. 13,01, P=0,057; anti-PR3: indice di stimolazione 7,72 vs. 13,00, P=0.026) (Figura 2A), mentre non è stata osservata alcuna differenza nell’indice di espressione della membrana o nella percentuale di cellule positive (Figura 2B, C). Inoltre, i livelli di mRNA nel sangue periferico di PR3, MPO, CD177, RUNX3 e JMJD3 sono stati misurati mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi. I pazienti con CHIP AAV hanno mostrato una maggiore espressione di mRNA MPO e PR3 rispetto ai livelli nei controlli sani (MPO: 1,94 vs. 0,86, P=0,026; PR3: 2,02 vs. 0,58, P=0,057), una differenza meno evidente nei pazienti con CHIP. Tuttavia, i pazienti con CHIP AAV hanno mostrato una ridotta espressione di mRNA RUNX3 rispetto al livello nei controlli sani (0.28 vs. 0.79, P=0.007) (Figura 2). A causa del piccolo numero di pazienti, non siamo stati in grado di suddividere ulteriormente i pazienti con CHIP AAV in base ai geni interessati o alle frequenze alleliche varianti e non abbiamo potuto quindi valutare il loro potenziale impatto sui nostri risultati (Tabella supplementare online S9). Inoltre, differenze significative nella conta dei neutrofili e dei linfociti tra pazienti AAV e controlli sani potrebbero aver influenzato i nostri risultati e limitare la capacità di trarre conclusioni generalizzate (Tabella supplementare online S10).

In summary, we detected CHIP in 34 out of 112 patients (30.4%), una prevalenza significativamente più alta rispetto a quella riportata in coorti sane e nel nostro gruppo di controllo abbinato all’età, ma paragonabile a frequenze aumentate riportate in pazienti con cancro,anemia aplastica 1218 e malattie cardiovascolari.5 Mentre la segnalazione infiammatoria alterata è stata proposta come meccanismo alla base dell’associazione di sindromi mielodisplastiche con malattie autoimmuni/condizioni infiammatorie,19 un meccanismo simile potrebbe collegare CHIP con tali condizioni e, in particolare, con AAV. La trascrizione disregolata di ANCA autoantigen è comunemente osservata in AAV e potrebbe essere alterata dal CHIP. È interessante notare che i pazienti CHIP, ma non CHIP AAV si sono manifestatiregolazione dell’espressione di mRNA autoantigen precedentemente riportata.119 Questa scoperta piuttosto sorprendente suggerisce che l’espressione dell’antigene ANCA sovraregolata è presumibilmente un fenomeno secondario nell’AAV, indotto da una segnalazione infiammatoria che è difettosa nelle cellule CHIP. In linea con ciò, è stata osservata una ridotta attivazione dei neutrofili indotta da ANCA nei pazienti con CHIP. È interessante notare che in precedenza abbiamo dimostrato che la produzione indotta da ANCA di specie reattive dell’ossigeno svolge un ruolo importante nella downregolazione dell’attivazione dell’infiammasoma mediante inibizione ossidativa della cascata dell’infiammasoma-caspasi-1-interleuchina-1β.20 La ridotta produzione di specie reattive dell’ossigeno da parte dei neutrofili CHIP che abbiamo trovato potrebbe, quindi, contribuire ad un’attivazione eccessiva dell’infiammasoma e quindi influenzare la patogenesi dell’AAV. Clinicamente, abbiamo trovato meno manifestazioni renali e neuronali nei pazienti con CHIP, supportando l’idea che CHIP funzioni come modificatore di malattia in AAV.

Nell’analisi longitudinale, più del 25% dei pazienti ha mostrato un aumento delle dimensioni dei cloni nel tempo senza alcun impatto significativo di un trattamento specifico sull’espansione dei cloni. La frequenza dei CHIP non è aumentata in pazienti precedentemente trattati con agenti immunosoppressivi / citotossici e non arricchiti per mutazioni coinvolte nella risposta al danno del DNA (Tabella supplementare online S11). Appare quindi improbabile che l’elevata prevalenza del CHIP sia semplicemente una conseguenza del trattamento citotossico e, insieme all’espansione delle dimensioni dei cloni, giustifica un monitoraggio più attento dei pazienti affetti da AAV a causa del noto rischio di progressione verso sindromi mielodisplastiche o leucemia mieloide acuta.1513

Collettivamente, i nostri dati rivelano una nuova associazione di AAV con CHIP con effetti potenzialmente modificanti la malattia come mostrato per l’attivazione dei neutrofili, la regolazione della trascrizione autoantigene e la manifestazione degli organi. Riconosciamo che, dati i test multipli, i valori P non rappresentano l’errore di tipo I globale. Studi futuri e indagini funzionali sono ora giustificati per confermare questi risultati e decifrare i meccanismi molecolari.

Genovese G, Kahler AK, Handsaker RE. Emopoiesi clonale e rischio di cancro del sangue dedotto dalla sequenza del DNA del sangue. N Ingl J Med. 2014; 371(26):2477-2487. Per maggiori informazioni: //10.1056/NEJMoa1409405Google Scholar
Steensma DP, Bejar R, Jaiswal S. Emopoiesi clonale di potenziale indeterminato e sua distinzione dalle sindromi mielodisplastiche. Sangue. 2015; 126(1):9-16. PubMedhttps://doi.org / 10.1182 / sangue-2015-03-631747Google Scholar
Buscarlet M, Provost S, Zada YF. DNMT3A e TET2 dominano l’emopoiesi clonale e dimostrano fenotipi benigni e diverse predisposizioni genetiche. Sangue. 2017; 130(6):753-762. PubMedhttps://doi.org / 10.1182 / sangue-2017-04-777029Google Scholar
Arends CM, Galan-Sousa J, Hoyer K. Distribuzione del lignaggio ematopoietico e dinamica evolutiva dell’emopoiesi clonale. Leucemia. 2018; 32(9):1908-1919. PubMedhttps://doi.org/10.1038/s41375-018-0047-7Google Scholar
Jaiswal S, Natarajan P, Silver AJ. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. N Engl J Med. 2017; 377(2):111-121. PubMedhttps://doi.org/10.1056/NEJMoa1701719Google Scholar
Fuster JJ, MacLauchlan S, Zuriaga MA. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 2017; 355(6327):842-847. PubMedhttps://doi.org/10.1126/science.aag1381Google Scholar
Frick M, Chan W, Arends CM. Ruolo dell’emopoiesi clonale del donatore nel trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeniche. J Clin Oncol. 2019; 37(5):375-385. PubMedGoogle Scholar
Savola P, Lundgren S, Keranen MAI. Emopoiesi clonale in pazienti con artrite reumatoide. Cancro del sangue J. 2018; 8(8):69. Google Scholar
Ciavatta DJ, Yang J, Preston GA. Base epigenetica per aberrante sovraregolazione dei geni autoantigeni nell’uomo con ANCA vasculite. J Clin Investire. 2010; 120(9):3209-3219. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1172 / JCI40034Google Scholar
Jones BE, Yang J, Muthigi A. Gene-specific DNA methylation changes predict remission in patients with ANCA-associated vasculitis. J Am Soc Nephrol. 2017; 28(4):1175-1187. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2016050548Google Scholar
McInnis EA, Badhwar AK, Muthigi A. Dysregulation of autoantigen genes in ANCA-associated vasculitis involves alternative transcripts and new protein synthesis. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):390-399. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013101092Google Scholar
Coombs CC, Zehir A, Devlin SM. L’emopoiesi clonale correlata alla terapia in pazienti con tumori non ematologici è comune e associata a esiti clinici avversi. Cellule staminali. 2017; 21(3):374-382.e4. PubMedhttps://doi.org / 10.1016 / j.stem.2017.07.010 Google Scholar
Desai P, Mencia-Trinchant N, Savenkov O. Le mutazioni somatiche precedono la leucemia mieloide acuta anni prima della diagnosi. Nat Med. 2018; 24(7):1015-1023. PubMedhttps: / / doi. org / 10.1038 / s41591-018-0081-zGoogle Scholar
Gibson CJ, Lindsley RC, Tchekmedyian V. Emopoiesi clonale associata a esiti avversi dopo trapianto autologo di cellule staminali per linfoma. J Clin Oncol. 2017; 35(14):1598-1605. PubMedGoogle Scholar
Abelson S, Collord G, Ng SWK. Predizione del rischio di leucemia mieloide acuta in individui sani. Natura. 2018; 559(7714):400-404. Google Scholar
Christen F, Hoyer K, Yoshida K. Paesaggio genomico ed evoluzione clonale della leucemia mieloide acuta con t(8;21): uno studio internazionale su 331 pazienti. Sangue. 2019; 133(10):1140-1151. PubMedhttps: / / doi. org/10.1182 / sangue-2018-05-852822Google Scholar
Damm F, Mylonas E, Cosson A. Ha acquisito mutazioni iniziali nelle prime cellule ematopoietiche di pazienti affetti da LLC. Cancro Discov. 2014; 4(9):1088-1101. PubMedhttps://doi.org / 10.1158 / 2159-8290.CD-14-0104Google Scholar
Yoshizato T, Dumitriu B, Hosokawa K. Mutazioni somatiche ed emopoiesi clonale nell’anemia aplastica. N Ingl J Med. 2015; 373(1):35-47. PubMedhttps://doi.org / 10.1056 / NEJMoa1414799Google Scholar
Sallman DA, List A. Il ruolo centrale della segnalazione infiammatoria nella patogenesi delle sindromi mielodisplastiche. Sangue. 2019; 133(10):1039-1048. PubMedhttps://doi.org/10.1182/blood-2018-10-844654Google Scholar
Schreiber A, Luft FC, Kettritz R. Phagocyte NADPH oxidase restrains the inflammasome in ANCA-induced GN. J Am Soc Nephrol. 2015; 26(2):411-424. PubMedhttps://doi.org/10.1681/ASN.2013111177Google Scholar

Lascia un commento Annulla risposta