Clemizole e modulatori della serotonina segnalazione di sopprimere i sequestri, la sindrome di dravet

Abstract

la sindrome di dravet è una catastrofica infanzia con epilessia ad esordio precoce crisi epilettiche, ritardo di linguaggio e dello sviluppo motorio, disturbi del sonno, ansia-come comportamento, grave deficit cognitivo e un aumento del rischio di mortalità. È causato principalmente da mutazioni de novo del gene SCN1A che codifica per un canale del sodio attivato dalla tensione neuronale. Il pesce zebra con una mutazione nell’omologo SCN1A ricapitola l’attività convulsiva spontanea e imita i movimenti comportamentali convulsivi osservati nella sindrome di Dravet. Qui, mostriamo che lo screening fenotipico delle librerie di farmaci nei mutanti scn1 di zebrafish identifica rapidamente e con successo nuove terapie. Dimostriamo che il clemizolo si lega ai recettori della serotonina e la sua attività antiepilettica può essere imitata da farmaci che agiscono sulle vie di segnalazione della serotonina, ad esempio trazodone e lorcaserina. In coincidenza con questi risultati di zebrafish, abbiamo trattato cinque pazienti con sindrome di Dravet intrattabili dal punto di vista medico con un agonista del recettore della serotonina clinicamente approvato (lorcaserin, Belviq®) e abbiamo osservato alcuni risultati promettenti in termini di riduzione della frequenza e/o gravità delle crisi. I nostri risultati dimostrano un percorso rapido dalla scoperta preclinica nel pesce zebra, attraverso l’identificazione del bersaglio, ai potenziali trattamenti clinici per la sindrome di Dravet.

Introduzione

Le epilessie infantili classificate come catastrofiche sono spesso associate a una mutazione genetica. Tra questi, la sindrome di Dravet è stata collegata a più di 600 mutazioni de novo in un singolo gene, SCN1A (Catterall et al., 2010; Escayg et al., 2010). I bambini affetti da sindrome di Dravet mostrano convulsioni a partire dai 6 mesi di età, ritardo del linguaggio e sviluppo motorio, disturbi del sonno, comportamento ansioso e grave deficit cognitivo (Dravet, 2011). Sono stati riportati anche sintomi del disturbo dello spettro autistico (Li et al., 2011) e il rischio di morte improvvisa inspiegabile con epilessia (SUDEP) in questa popolazione è stimato a 15 volte superiore rispetto ad altre epilessie infantili (Kearney, 2013). I farmaci antiepilettici disponibili non offrono un adeguato controllo delle crisi e le procedure neurochirurgiche resettive non sono comunemente un’opzione. I nuovi trattamenti per la sindrome di Dravet rimangono un’importante necessità insoddisfatta nonostante un certo livello di efficacia in studi clinici limitati per cannabidiolo (Epidiolex®) e stiripentolo (Diacomit®), che possono essere associati rispettivamente a problemi di sicurezza cognitiva o dell’appetito (Perez et al., 1999; Chiron et al., 2000; Detyniecki et al., 2016; Devinsky et al., 2016).

Mutazioni in SCN1A, un gene che codifica la subunità α-formante pori di un canale del sodio voltaggio-dipendente (Nav1.1), sono state identificate in quasi l ‘ 85% dei pazienti con sindrome di Dravet (Dravet, 2011). I canali Nav1.1 contribuiscono alla rapida depolarizzazione delle membrane neuronali osservate durante la generazione del potenziale d’azione (Hodgkin et al., 1952). I topi eterozigoti per una mutazione di perdita di funzione in Nav1.1 sviluppano convulsioni spontanee e sensibili alla temperatura all’inizio della vita e muoiono prematuramente intorno al giorno postnatale 25 (Yu et al., 2006; Oakley et al., 2009; Cheah et al., 2012). Studi di elettrofisiologia acuta in questi e relativi topi Scn1a-carenti suggeriscono una riduzione della densità di corrente di sodio e una diminuzione associata nell’attività di cottura per una sottopopolazione di neuroni inibitori che esprimono GABA (ma non cellule principali eccitatorie) che culminano in ridotta inibizione sinaptica e ipereccitabilità della rete (Yu et al., 2006; Kalume et al., 2007; Han et al., 2012). Questa ipotesi di “interneuronopatia” è coerente con altre forme di epilessie infantili catastrofiche ed è stata confermata nei topi in cui Scn1a è stato eliminato selettivamente dalle sottopopolazioni di interneuroni che esprimono parvalbumina o somatostatina (Dutton et al., 2013; Tai et al., 2014). Comportamenti di tipo autistico sono stati riportati anche in questi topi (Han et al., 2012). È interessante notare che gli studi iniziali sui neuroni eccitatori e inibitori umani derivati utilizzando la tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte da due pazienti con sindrome di Dravet hanno riportato deficit nella corrente sodica attivata dalla tensione per entrambi i tipi di cellule, suggerendo una compensazione omeostatica per la perdita precoce della funzione di un canale critico del sodio specifico per il cervello, o meccanismi, 2013; Liu et al., 2013).

Sebbene i topi e i neuroni derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo contribuiscano alla nostra comprensione della fisiopatologia sottostante della sindrome di Dravet, questi sistemi non sono adatti per la rapida identificazione di nuove terapie a causa della variabilità di questi modelli e della riproducibilità delle misurazioni quantitative. Come zebrafish sono un sistema di modello vertebrato ideale per l’esecuzione di schermi a base di fenotipo di piccole molecole (MacRae et al., 2015), e sono suscettibili di manipolazioni genetiche, abbiamo focalizzato i nostri sforzi su un mutante del canale del sodio zebrafish. I mutanti Zebrafish che ospitano una mutazione missense di perdita di funzione nell’ortologo SCN1A, scn1Lab, sono stati identificati in uno schermo di mutagenesi (Schoonheim et al., 2010). A causa di una duplicazione ancestrale dell’intero genoma, i mutanti dello zebrafish scn1Lab sono aploinsufficienti per Nav1.1 e analoghi ai topi Scn1a+/− o ai pazienti con sindrome di Dravet. Comportamenti convulsivi ed episodi di breve interictale e di lunga durata polyspike ictal-come scarica elettrografica sono osservati in larve mutanti già 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) con progressione a fenotipi sequestro più robusti tra 4 e 7 dpf (Baraban et al., 2013; Hong et al., 2016). Le larve mutanti muoiono prematuramente, presentano deficit metabolici (Kumar et al., 2016), e sono resistenti a molti farmaci antiepilettici (AEDs) (Dinday et al., 2015). Simile alla gestione clinica della sindrome di Dravet, una certa attenuazione dell’attività convulsiva può essere ottenuta con valproato, benzodiazepine, bromuri, stiripentolo e una dieta chetogenica (Baraban et al., 2013). Utilizzando le larve di zebrafish mutanti scn1Lab e una strategia di screening basata sul fenotipo a due stadi, abbiamo ora esaminato più di 2300 composti. Clemizolo, un antagonista del recettore dell’istamina (H1) di prima generazione, è stato identificato come un potente inibitore dell’attività comportamentale ed elettrografica delle convulsioni (Baraban et al., 2013). Gli antistaminici, tuttavia, sono controindicati nelle popolazioni di epilessia pediatrica (Miyata et al., 2011) e l’analogo del recettore H1 in zebrafish mostra meno del 50% di somiglianza con l’uomo (Peitsaro et al., 2007). Qui, usiamo modelli di zebrafish preclinici per dimostrare che clemizolo, ma non antistaminici, esercitano attività antiepilettica. Sulla base del legame del ligando e dello screening farmacologico mirato aggiuntivo in zebrafish mutante scn1, abbiamo identificato diversi modulatori della serotonina (5-HT) come efficaci nel sopprimere le convulsioni, inclusi due composti approvati dalla FDA (trazodone e lorcaserina). Lorcaserin (Belviq®) è stato prescritto nell’ambito di un programma di uso compassionevole a bambini con sindrome di Dravet e ha comportato una ridotta attività convulsiva in alcuni pazienti. Proponiamo che la modulazione della segnalazione 5-HT rappresenti un nuovo intervento terapeutico per questa epilessia infantile catastrofica.

Materiali e metodi

Zebrafish manutenzione

Monitoraggio delle crisi

A 5 dpf le singole larve di zebrafish sono state collocate in un singolo pozzetto di una micropiastra trasparente a fondo piatto da 96 pozzetti contenente terreni embrionali. Le larve sono state selezionate casualmente poiché la determinazione del sesso non è possibile in questa fase. Le micropiastre sono state posizionate all’interno del dispositivo di tracciamento del movimento DanioVision e acclimatate per 20 min a temperatura ambiente. I diagrammi di locomozione sono stati ottenuti per ogni pozzo durante un’epoca di registrazione di 10 min utilizzando un sistema DanioVision che esegue il software EthoVision XT (DanioVision, Noldus Information Technology); le impostazioni di rilevamento delle soglie per identificare gli oggetti più scuri dello sfondo sono state ottimizzate per ogni esperimento. Il punteggio delle crisi è stato eseguito utilizzando la seguente scala a tre stadi stabilita per le crisi indotte da pentilenetetrazolo (Baraban et al., 2005): Stadio 0, nessuna o pochissima attività di nuoto; Stadio I, aumento, brevi periodi di attività di nuoto; Stadio II, rapido comportamento di nuoto circolante simile a un vortice; e Stadio III, convulsioni parossistiche simili a cloni del corpo intero e una breve perdita di postura. I pesci selvatici sono normalmente segnati allo stadio 0 o I. I grafici sono stati analizzati per la distanza percorsa (in millimetri) e la velocità media (in millimetri al secondo). Come riportato in precedenza (Winter et al., 2008; Baraban et al., 2013), i cambiamenti di velocità sono stati il test più sensibile del comportamento convulsivo.

Per studi di elettrofisiologia, le larve di zebrafish sono state brevemente paralizzate con α-bungarotossina (1 mg/ml) e immobilizzate in agarosio all ‘ 1,2%; le registrazioni del potenziale di campo locale sono state ottenute da strutture del proencefalo usando una tecnica a elettrodo singolo, come precedentemente descritto (Baraban et al., 2005; Hong et al., 2016). Sono state ottenute sessioni di registrazione del potenziale di campo locale incorporate in agarosio da 10 a 30 min per ciascun pesce a 1 kHz. Il sistema iZAP (Hong et al., 2016) è stato utilizzato per il monitoraggio non invasivo a lungo termine del pesce zebra in assenza di un agente paralizzante. Il sistema intrappola autonomamente diverse larve di zebrafish sotto più elettrodi di superficie integrati all’interno delle camere microfluidiche. Le larve di scn1Lab sono state continuamente monitorate per 5 h. Il potenziale del campo elettrico è stato registrato a 1 kHz continuamente tranne pause da 2 a 3 min per il cambio dei media per il trattamento e il lavaggio dei composti. I dati registrati sono stati analizzati utilizzando MATLAB per i grafici del potenziale di campo e l’analisi della frequenza.

Compound library screening

I composti per lo screening dei farmaci sono stati acquistati da Selleck Chemicals e sono stati forniti come soluzioni DMSO da 10 mm. Per lo screening sono state utilizzate la libreria Ion Channel Ligand di Selleck (Catalogue #L2700), la GPCR Compound Library (Catalogue #L2200) e una libreria modulante personalizzata 5-HT. I composti della biblioteca sono elencati nella tabella supplementare 1. In tutti gli schermi della biblioteca della droga, i composti sono stati codificati e gli esperimenti sono stati eseguiti dagli investigatori che erano ciechi alla natura del composto. Le registrazioni basali del comportamento di locomozione sono state ottenute da mutanti nei media embrionali, come descritto sopra; un secondo diagramma di locomozione è stato quindi ottenuto dopo un cambio di soluzione in un composto di prova e un periodo di equilibrio di 20 min. I composti per gli studi di locomozione sono stati disciolti in terreni embrionali e sono stati testati a una concentrazione di 250 µM, con una concentrazione finale di DMSO del 2,5%.

I criteri per la designazione di hit positivo erano i seguenti: i) una diminuzione della velocità media ≥40%; e ii) una riduzione al comportamento convulsivo di Stadio 0 o Stadio I nel terreno di locomozione per almeno il 50% dei pesci in esame. Ogni composto di prova classificato come “hit positivo” nel test di locomozione è stato valutato per tossicità mediante visualizzazione diretta su uno stereomicroscopio a seguito di un’esposizione al farmaco di 90 minuti. La tossicità (o mortalità) è stata definita come assenza di battito cardiaco o movimento visibile in risposta alla stimolazione esterna in almeno il 50% dei pesci in esame. L’ipereccitabilità è stata definita come un composto che causa un aumento ≥40% della velocità di nuotata e/o dell’attività convulsiva di stadio III in almeno il 50% dei pesci in esame. I risultati positivi identificati nello schermo di locomozione primario sono stati confermati utilizzando il metodo di screening della locomozione in un secondo test con una frizione indipendente di zebrafish. I composti sono stati quindi acquistati separatamente da Sigma-Aldrich e testati utilizzando il metodo di screening della locomozione per la terza volta su una frizione indipendente di zebrafish. I farmaci che hanno ridotto la velocità media di nuotata sopra la soglia e non erano tossici nei tre saggi di locomozione indipendenti sono stati ulteriormente analizzati utilizzando il test elettrofisiologico. Negli studi di elettrofisiologia, i farmaci sono stati confermati per la prima volta a una concentrazione di 250 µM utilizzando il test di locomozione e quindi lo stesso pesce zebra è stato valutato utilizzando una registrazione del potenziale di campo locale. Tutto lo screening è stato fatto con composti codificati e analizzati dagli investigatori accecati all’identità del composto.

Analisi filogenetica

L’analisi filogenetica delle sequenze proteiche HTR2 umane e zebrafish Htr2 è stata eseguita con il software PhyML sotto i parametri di test del rapporto di verosimiglianza simile a SH (http://www.phylogeny.fr/) (Dereeper et al., 2008). Le sequenze proteiche sono state derivate da Ensembl human HTR2A (EN00000542664), HTR2B (EN00000258400), HTR2C (EN00000276198) e zebrafish htr2aa (ENSDART00000141502), htr2ab (ENSDART00000150982), htr2b (ENSDART00000104569), htr2cl1 (ENSDART00000024191) sequenze.

Analisi quantitativa dell’espressione di mRNA in tempo reale

I livelli di espressione dei geni htr2 del pesce zebra sono stati esaminati utilizzando RNA raggruppati da 25 teste o code di 5 larve mutanti omozigote dpf wild-type o scn1Lab e cervelli sezionati da singoli pesci zebra maschi adulti wild-type. L’RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol® (Invitrogen), secondo il protocollo del produttore e trattato con DNasi I (Invitrogen). L’mRNA purificato è stato retrotrascritto al cDNA utilizzando il sistema di sintesi di primo filamento SuperScript®III(Invitrogen) con una miscela di oligo (dT)20. I livelli di espressione dei geni zebrafish htr2 e del fattore di allungamento della traduzione eucariotica del gene housekeeping 1 alpha 1, come 1 (eef1a1l1) sono stati determinati utilizzando una macchina StepOne™ Real-Time PCR (Applied Biosystems). Le reazioni sono state eseguite in volumi da 20 µl su piastre a 96 pozzetti utilizzando SYBR ® Green Master Mix (Applied Biosystems), con primer da 250 nM e 3 µl di cDNA. Le sequenze oligonucleotidiche sono elencate nella Tabella supplementare 2. I dati sono stati analizzati da tre esperimenti indipendenti. I dati sono stati espressi come valori Ct e utilizzati per determinare i valori ΔCt.

Studi sull’uomo

Dopo il successo dell’identificazione dei composti nel nostro modello zebrafish e la considerazione della farmacocinetica, ai bambini è stato prescritto Belviq® (lorcaserin) sotto un protocollo di uso compassionevole presso l’Ospedale pediatrico Colorado (IND 125307). I bambini si sono qualificati per l’uso di Belviq® se hanno avuto una mutazione SCN1A o una diagnosi clinica della sindrome di Dravet e hanno fallito almeno due farmaci tra cui stiripentolo in alcuni casi ed esclusi i bloccanti dei canali del sodio. Ai bambini è stato richiesto un elettrocardiogramma ed ecocardiogramma al basale e ogni 6 mesi durante l’uso del prodotto. Inoltre, è stato richiesto di effettuare visite di follow-up ogni 3 mesi per garantire una crescita adeguata e valutare ulteriori effetti collaterali. Sono stati richiesti test di laboratorio ogni 6 mesi per includere test ematologici, test di funzionalità epatica e test di funzionalità renale. La dose di Belviq® è stata iniziata a 2,5 mg al momento di coricarsi e gradualmente aumentata settimanalmente secondo necessità fino a una dose massima di 10 mg due volte al giorno o 0,3 mg/kg/die—a seconda di quale si è verificata per prima.

È stata ottenuta l’approvazione del comitato di revisione istituzionale per la raccolta retrospettiva dei dati, inclusa una rinuncia al consenso. I dati sono stati estratti da una revisione retrospettiva delle cartelle cliniche elettroniche presso l’ospedale pediatrico Colorado, tra cui età, tipi di crisi e frequenza prima e dopo l’uso di Belviq®, eventi avversi, dose di Belviq® e uso concomitante di farmaci.

Analisi statistica

I dati sono presentati come errore medio ± standard della media (SEM), salvo diversa indicazione. Per il confronto tra due gruppi di studenti t-test sono stati utilizzati. Quando la varianza non aveva una distribuzione normale è stato utilizzato il test U Mann-Whitney non parametrico. ANOVA a senso unico dopo il test di confronto multiplo di Dunnett per l’analisi contro un campione di controllo o confronti multipli a coppie Holm-Sidak tra i mezzi. Le differenze considerate statisticamente significative sono indicate con asterischi (*P < 0,05; * * P < 0,01).

Risultati

Effetto del clemizolo sul comportamento convulsivo nel pesce zebra

Abbiamo trattato larve mutanti scn1Lab (5 dpf) con clemizolo a concentrazioni comprese tra 30 e 400 µM e quindi monitorato l’effetto sul comportamento convulsivo spontaneo utilizzando un software di locomozione automatizzato. Sulla base di 250 studi ripetuti di controllo della locomozione in mutanti scn1Lab non trattati, è stata fissata una riduzione della velocità media di nuoto ≥40% (>1,5 × DS) rispetto al basale come soglia per la soppressione positiva del comportamento convulsivo. Clemizolo (Fig. 1A) ha mostrato attività antiepilettica a 300 e 400 µM (esposizione di 30 minuti) e a 100 µM (esposizione di 90 minuti) (Fig. 1B); esposizioni prolungate erano tossiche alle concentrazioni più elevate. Per determinare se clemizolo può sopprimere il comportamento convulsivo spontaneo in un secondo mutante scn1 zebrafish, abbiamo esaminato le larve mutanti scn1Laa (5 dpf) nel test di tracciamento della locomozione. Larve identificate come comportamento convulsivo di stadio III (ad esempio convulsioni di tutto il corpo, attività di nuoto ad alta velocità e una breve perdita di postura; Fig. 1C) sono stati confermati come esibendo scariche elettrografiche con componenti interictal – e ictal-like nelle successive registrazioni sul campo dal proencefalo (Fig. 1D). La velocità media di nuotata per le larve identificate come zebrafish S3 o “mutanti scn1Laa putativi” era significativamente più alta rispetto ai controlli fratelli o a tutte le larve testate (Fig. 1E); i mutanti sono stati confermati come omozigoti scn1Laa mediante PCR post hoc. Abbiamo quindi testato farmaci precedentemente dimostrati per sopprimere le convulsioni spontanee nella sindrome di Dravet e mutanti scn1Lab (250 µM stiripentolo e 250 µM diazepam) e 250 µM lamotrigina (un DAE che può aggravare le convulsioni nella sindrome di Dravet). Come previsto lo stiripentolo e il diazepam, ma non la lamotrigina, hanno significativamente soppresso il comportamento convulsivo nelle larve mutanti di scn1Laa; anche il clemizolo da 250 µM è risultato efficace in questo test (Fig. 1F). Insieme, questi studi dimostrano che clemizolo può sopprimere il comportamento convulsivo in due diverse linee di zebrafish mutanti scn1.

Indagine sul meccanismo d’azione di clemizolo

Lo schermo secondario della droga facendo uso dei mutanti scn1Lab

Screening terziario per identificare i promettenti composti di piombo per la clinica

5-Espressione del recettore HT nelle larve di zebrafish

Poiché clemizolo ha una significativa affinità di legame con HTR2A e HTR2B, e sia il trazodone che il lorcaserin sono modulatori di segnalazione 5-HT, abbiamo cercato di confermare l’espressione di questi recettori nello zebrafish. L’allineamento della sequenza proteica dei recettori HTR2 umani e zebrafish ha rivelato la conservazione evolutiva con ortologhi zebrafish, con Htr2aa e Htr2ab entrambi che mostrano l’identità proteica 59.3% con HTR2A umano; e un singolo ortologo HTR2B, Htr2b che mostra l’identità proteica 62.0%. La quantificazione del livello di espressione di htr2 utilizzando teste o code isolate di 5 larve mutanti di tipo selvaggio o scn1Lab dpf ha rivelato un’espressione arricchita di htr2a e htr2cl1 nella testa. Risultati simili sono stati ottenuti dal cervello adulto di zebrafish wild-type, poiché le larve mutanti non sopravvivono all’età adulta (Fig. 4).

Riduzione della frequenza delle convulsioni in pazienti con sindrome di Dravet

La sindrome di Dravet è un’epilessia infantile catastrofica e una malattia rara (http://www.rarediseases.org/) con esiti debilitanti tra cui epilessia intrattabile, sviluppo cognitivo gravemente limitato e rischio di SUDEP. I nostri dati preclinici confermano che la modulazione della segnalazione 5-HT può sopprimere le convulsioni associate a mutazioni di perdita di funzione di SCN1A. Poiché i modulatori 5-HT identificati sono composti approvati dalla FDA con profili di sicurezza noti, il trattamento con questi farmaci riproposti potrebbe alterare la frequenza delle convulsioni nei bambini con sindrome di Dravet. Questo approccio traslazionale si rivolge a malattie rare e devastanti per le quali gli studi clinici su larga scala non sono fattibili (Dunoyer, 2011; Parker et al., 2013).

Poiché clemizolo non è attualmente prodotto o disponibile nella formulazione di grado clinico e trazodone può agire come agonista del recettore 5-HT, o antagonista, a seconda della concentrazione (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998), abbiamo scelto di valutare Belviq® (lorcaserin) nell’ambito di un programma di uso compassionevole off-label in una piccola popolazione di bambini con sindrome di Dravet. Questi bambini hanno dimostrato di essere resistenti ad almeno cinque AED approvati. Cinque bambini (età media: 11,8 anni; intervallo: 7-18 anni) eterozigoti per una delezione in SCN1A sono stati trattati prospetticamente con Belviq® e seguiti longitudinalmente presso l’Ospedale pediatrico Colorado (Aurora, CO). Il protocollo di trattamento è stato approvato dal Colorado Medical Institutional Review Board (COMIRB) e i genitori dei pazienti con sindrome di Dravet hanno acconsentito per iscritto alla partecipazione del loro bambino. Abbiamo esaminato retrospettivamente il numero riportato dal diario di convulsioni atoniche, miocloniche e generalizzate tonico-cloniche (GTC), effetti collaterali e DAE concomitanti.

Le caratteristiche cliniche dei bambini con sindrome di Dravet trattati con Belviq® sono riassunte nella Tabella 1. Non ci sono stati decessi tra i cinque pazienti trattati con Belviq®e Belviq® è stato ben tollerato senza gravi eventi avversi che hanno causato la cessazione della terapia. Durante il trattamento off-label con Belviq®, un paziente era inizialmente privo di crisi per 3 settimane, un paziente era privo di crisi per 2 settimane e un terzo paziente aveva 1-2 giorni senza crisi a settimana. Tutti e cinque i pazienti hanno mostrato una riduzione del numero totale di convulsioni. Le crisi tonico-cloniche generalizzate sono state significativamente ridotte nei pazienti 1, 2 e 3. In effetti, il paziente 2 ha avuto una riduzione del 90% delle crisi tonico-cloniche generalizzate senza bisogno di farmaci di salvataggio. Due pazienti rimangono su Belviq® senza aumento della frequenza delle crisi e, come previsto, l’effetto collaterale più comune osservato è stato un calo dell’appetito. Un paziente ha riavviato il farmaco una seconda volta con un miglioramento intermedio per un breve periodo di tempo e poi si è attenuato.

Discussione

Clemizolo, un antistaminico di prima generazione scoperto nel 1950 s (Zierz et al., 1952), è stato identificato come un potenziale terapeutico per il trattamento della sindrome di Dravet utilizzando il pesce zebra mutante scn1Lab per schermare le librerie di farmaci riproposte (Baraban et al., 2013; Dinday et al., 2015). Qui abbiamo confermato un’attività antiepilettica per clemizolo utilizzando un secondo modello mutante scn1 zebrafish. Sfortunatamente, clemizolo viene rapidamente metabolizzato nei topi con un’emivita plasmatica di < 10 min (rispetto a 3,4 h nell’uomo) (Nishimura et al., 2013), limitando la sua valutazione in modelli murini. Utilizzato con successo come antistaminico (Zierz et al., 1952; Jacques et al., 1960) con studi acuti e cronici che riportano un basso ordine di tossicità (Finkelstein et al., 1960), clemizolo non è più prodotto e non è attualmente disponibile per la somministrazione clinica off-label. In mancanza di un mezzo per valutare in modo efficiente clemizolo in modelli preclinici di roditori, abbiamo usato zebrafish per target engagement (recettori 5-HT) e identificazione di farmaci correlati (trazodone e lorcaserin) con profili di sicurezza appropriati che facilitano la rapida traduzione in un’applicazione clinica. Viene anche descritto l’uso compassionevole, la prescrizione off-label di Belviq® (lorcaserin) ai pazienti con sindrome di Dravet intrattabili dal punto di vista medico.

Gli antagonisti del recettore H1 antistaminico sono normalmente controindicati nelle popolazioni di pazienti pediatrici (Miyata et al., 2011) e lo screening di questi farmaci ha confermato la loro incapacità di sopprimere (e in alcuni casi esacerbare) le convulsioni nel pesce zebra scn1. I dati di legame hanno scoperto un’affinità di clemizolo precedentemente sconosciuta per i recettori HTR2A e/o HTR2B. Una successiva schermata fenotipica di librerie mirate ha identificato due composti modulanti 5-HT, trazodone e lorcaserina, in grado di sopprimere le crisi comportamentali ed elettrofisiologiche in modo paragonabile al clemizolo. Belviq® (lorcaserin) è un agonista HTR2C approvato dalla FDA prescritto per la gestione cronica del peso (Thomsen et al., 2008). Desyrel® (trazodone) è anche un antidepressivo approvato dalla FDA comunemente prescritto per i disturbi del sonno (Mendelson, 2005). È spesso classificato come antagonista inverso HTR2A e HTR2C e inibitore di assorbimento 5-HT (Stahl, 2009). Tuttavia, studi sui ratti suggeriscono che il trazodone, o il suo metabolita meta-clorofenilpiperazina (mCPP), può agire come agonista HTR2C a concentrazioni più elevate (Maj et al., 1979; Marcoli et al., 1998). In particolare, il trattamento con trazodone cronico è stato precedentemente dimostrato protettivo contro le convulsioni indotte da elettroconvulsive nei topi (Chavan et al., 2010; Borowicz et al., 2012), supportando i nostri dati da scn1Lab mutant zebrafish. Un’azione mediata dal recettore 5-HT per clemizolo è anche coerente con un recente schermo fenotipico in cui i modulatori della segnalazione serotoninergica (incluso clemizolo) hanno dimostrato di essere un trattamento efficace in un modello preclinico della malattia di Machado-Joseph (Teixeira-Castro et al., 2015); e gli studi qui suggeriscono che clemizolo e trazodone garantiscono un ulteriore sviluppo per i test off-label in pazienti con sindrome di Dravet.

I nostri risultati si aggiungono anche a un crescente corpo di prove che suggeriscono la modulazione della segnalazione serotoninergica come un potente soppressore dell’attività convulsiva, specialmente nelle epilessie infantili catastrofiche come la sindrome di Dravet. Recentemente, 7 pazienti su 10 in trattamento a basse dosi con fenfluramina bloccante della ricaptazione 5-HT sono stati auto-segnalati come privi di crisi per 1 anno (Ceulemans et al., 2016). Un leggero ispessimento di una o due valvole cardiache è stato riportato in due di questi pazienti coerente con una possibile relazione tra l’uso di fenfluramina e ipertensione polmonare (Douglas et al., 1981; Ceulemans et al., 2016). Nell’uomo, HTR2A e HTR2C sono espressi nel SNC, mentre l’espressione di HTR2B è arricchita nel cuore (Lambe et al., 2011; Meltzer et al., 2013). Più specificamente, HTR2C è espresso su una sottopopolazione di interneuroni inibitori (Liu et al., 2007) e l’attivazione di questi recettori con 5-HT aumenta l’inibizione sinaptica mediata da GABA (Boothman et al., 2006) cioè il meccanismo antiepilettico di azione alla base di molti farmaci antiepilettici comunemente prescritti. In effetti, la maggior parte degli studi preclinici suggeriscono che l’attivazione dei recettori HTR2A e/o HTR2C abbia effetti antiepilettici (Gharedaghi et al., 2014; Guiard et al., 2015), che è un ragionevole meccanismo d’azione che collega clemizolo, lorcaserin, trazodone e la fenfluramina bloccante della ricaptazione 5-HT (Dinday et al., 2015; Ceulemans et al., 2016). È interessante notare che l’espressione di htr2b nel cervello del pesce zebra era relativamente bassa, suggerendo inoltre che questi farmaci potenzialmente esercitano attività antiepilettica tramite l’attivazione del recettore HTR2A o HTR2C. È interessante notare che studi in Drosophila knock-in mosche che trasportano la mutazione umana K1270T SCN1A nel gene del canale del sodio para hanno dimostrato che l’integrazione con un precursore 5-HT (5-idrossitriptofano) salva il fenotipo di sequestro indotto dal calore (Schutte et al., 2014). Inoltre, un recente studio con mutanti scn1Lab ha valutato 13 composti di segnalazione 5-HT e ha anche suggerito un potenziale ruolo antiepilettico per i modulatori di segnalazione 5-HT (Sourbron et al., 2016). Tuttavia, questi ultimi studi sul pesce zebra hanno utilizzato un protocollo fondamentalmente diverso (24 ore contro 30-90 minuti di esposizione al farmaco) non precedentemente convalidato come identificazione con successo degli AED utilizzati nella sindrome di Dravet (benzodiazepine, valproato, stiripentolo, bromuri e dieta chetogenica). Inoltre, le concentrazioni di farmaci sono circa 10 volte inferiori a quelle che dimostriamo essere efficaci nel pesce zebra (Baraban et al., 2005, 2013; Dinday et al., 2015), e riportando un’azione antiepilettica per l’allucinogeno TCB-2 (Fig. 5), suggerisce che il confronto diretto dei dati provenienti da laboratori che utilizzano procedure diverse dovrebbe essere interpretato con cautela.

Nel complesso, concludiamo che il pesce zebra mutante è un modello adatto per lo screening rapido e la scoperta di nuovi AED che, con appropriati profili di sicurezza, possono informare direttamente l’assistenza clinica per le popolazioni di pazienti a rischio come la sindrome di Dravet.

Abbreviazioni

Abbreviazioni
• 5-HT

  serotonina

• AED

  farmaci antiepilettici

• dpf

  giorni dopo la fecondazione

• GPCR

  G-protein-coupled receptor

• iZAP

  integrato di zebrafish piattaforma di analisi

Ringraziamenti

vorremmo ringraziare i membri del Baraban di laboratorio, Brian Grone e Matteo Dinday in particolare, per utile discussioni nel corso di questi studi.

Finanziamento

SCB riconosce il finanziamento da NINDS R01 grant no. NS079214, UCSF Catalyst Award e il Raymond & Beverley Sackler Centre Sabbatico Fondo.

Materiale supplementare

Materiale supplementare è disponibile presso Brain online.