8.25.2.1.2 Reduced enzymatic detoxification
BLM è generalmente riconosciuto come clastogenic non specifico; tuttavia, la sua tossicità è altamente selettiva per le cellule polmonari. Il meccanismo di questa tossicità polmonare-selettiva non è stato completamente risolto. Alcune potenziali spiegazioni meccanicistiche per questa tossicità selettiva del tessuto includono una ridotta capacità delle cellule polmonari di avviare la riparazione del DNA (recensita in Chen e Stubbe 2005), una maggiore ritenzione di BLM da un maggiore afflusso o un ridotto efflusso (recensito in Chen e Stubbe 2005), o la ridotta capacità enzimatica delle cellule epiteliali polmonari di disintossicare BLM. L’evidenza culminante in letteratura supporta l’ipotesi che i livelli ridotti di bleomicina idrolasi (BlmX, Blmh) nel polmone e di conseguenza la ridotta disintossicazione enzimatica di BLM possano svolgere un ruolo importante nell’accumulo di BLM e nella tossicità polmonare.
Blmh è una proteasi della cisteina che assomiglia alla subunità 20S del proteasoma (Joshua-Tor et al. 1995). Blmh è stato scoperto per la prima volta attraverso la sua capacità di inattivare metabolicamente BLM A2 al metabolita BLM primario deamido-BLM A2 (Da2), che sembra essere l’unico metabolita di BLM (Schwartz et al. 1999). Blmh è stato clonato e mantiene l’attività della deamidasi BLM in più eucarioti tra cui lievito (Xu e Johnston 1994), coniglio (Sebti e Lazo 1987; Sebti et al. 1987, 1989), ratto (Takeda et al. 1996a, b), e umano (Bromme et al. 1996; Ferrando et al. 1996). Blmh catalizza efficacemente la deamidazione di entrambe le isoforme BLM presenti nella miscela clinica, blenoxane A2 e B2, idrolizzando l’ammina terminale ed eliminando un sito di coordinazione del metallo (Morris et al. 1991; Sebti et al. 1987). Entrambi umani (Bromme et al. 1996) e coniglio (Sebti et al. 1989) i blmh erano più efficienti nel catalizzare la deamidazione di BLM B2 rispetto a quella di BLM A2. Studi genotossici in vitro hanno dimostrato che il dA2 è significativamente meno attivo nella produzione di fenditure a filamento singolo o doppio filamento utilizzando entrambi i fagi (Huang et al. 1981) o modelli di DNA plasmidico (Zou et al. 2002). Coerentemente con questi risultati, la forma deamidata di BLM è risultata essere da 6 a 35 volte meno potente del composto genitore nella sua capacità di inibire la proliferazione del carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (Lazo 1989, p. 436). La sovraespressione di Blmh umano nelle cellule CHO ha anche protetto le cellule dalla genotossicità indotta da BLM, presumibilmente mediante conversione di BLM nella forma deamidata (Lefterov et al. 1998). In vivo, l’iniezione di dA2 non è riuscita a dimostrare tossicità polmonare attraverso i livelli di idrossiprolina, che è un indicatore di aumento del collagene e della fibrosi polmonare (Lazo e Humphreys 1983). Una possibile spiegazione di questa mancanza di tossicità è che dA2 non è in grado di accumularsi nelle cellule polmonari o non è tossico per le cellule polmonari.
È ben stabilito, almeno negli studi sugli animali, che la ridotta attività del Blmh è un fattore che contribuisce in modo significativo alla tossicità polmonare indotta dal BLM. I topi knockout Blmh non erano in grado di generare il metabolita DA2 ed erano significativamente più suscettibili allo sviluppo di fibrosi polmonare indotta da BLM rispetto ai loro controlli wild-type (Schwartz et al. 1999). BLM a basso dosaggio a 25 mg kg-1 ha aumentato i livelli di idrossiprolina del 30% nei topi knockout rispetto a nessun cambiamento nei topi wild-type. Un altro studio genetico, utilizzando le differenze di ceppo nella suscettibilità BLM (C3 resistente al BLM, C56/Bl6 sensibile al BLM), ha identificato due loci genetici che conferiscono suscettibilità, designati blmpf1 e blmpf2. blmpf1 è stato localizzato al gene principale del complesso di istocompatibilità (MHC), mentre il secondo locus, blmpf2, è stato localizzato al cromosoma 11 e ha conferito una suscettibilità specifica al BLM (Haston et al. 2002). Gli autori hanno concluso che almeno uno dei geni nella regione blmpf2 è probabilmente Blmh. Studi sull’uomo hanno esaminato le differenze nei polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) nell’estremità C-terminale del gene Blmh. Tuttavia, questi studi non hanno identificato una correlazione tra SNP e tossicità polmonare (Nuver et al. 2005), sebbene la SNP (G/G) sia correlata con una ridotta sopravvivenza globale dei pazienti testicolari che ricevono un trattamento di combinazione BLM (de Haas et al. 2008). Sono necessari ulteriori studi per determinare se questo SNP riduce l’inattivazione metabolica della BLM e contribuisce alla morbilità dei pazienti trattati con chemioterapia a base di BLM.
Enzimaticamente, è chiaramente stabilito che l’attività Blmh verso BLM A2 è diminuita nei polmoni delle specie sensibili e che questa diminuzione è correlata alla fibrosi polmonare come indicato attraverso elevati livelli di idrossiprolina all’interno del polmone (Lazo e Humphreys 1983). I conigli resistenti alla fibrosi polmonare indotta da BLM mostrano tassi di conversione simili di BLM A2 a Da2 nei polmoni e in altri tessuti, mentre i topi non hanno mostrato attività enzimatica polmonare per BLM A2 (Lazo e Humphreys 1983). Inoltre, i topi knockout senza Blmh funzionale dimostrano ipersensibilità alla fibrosi polmonare indotta da BLM (Schwartz et al. 1999).
È ipotizzabile che l’attività differenziale osservata di Blmh possa spiegare la predisposizione alla tossicità nei polmoni. Questa attività differenziale potrebbe potenzialmente essere spiegata attraverso livelli di espressione Blmh differenziali nei polmoni e in altri tessuti. L’analisi nordica ha dimostrato bassi livelli di espressione di Blmh nel polmone e nel fegato, con la massima espressione osservata nel testicolo e nel muscolo scheletrico (Bromme et al. 1996). È interessante notare che le cellule alveolari umane di tipo II hanno mostrato il livello più basso di espressione Blmh tra gli otto tipi di cellule tumorali analizzati (Bromme et al. 1996). I dati che esaminano i livelli di proteine all’interno del polmone sono scarsi. A nostra conoscenza, c’è stato solo uno studio che esamina le differenze proteiche Blmh tra i tessuti nei ratti. Utilizzando ELISA e western blotting, Kamata et al. (2007) ha osservato che i livelli di proteine Blmh nel polmone erano circa la metà di quelli identificati nel fegato di ratti di 6 settimane. Tuttavia, nessuno ha tentato di identificare queste differenze all’interno delle sottopopolazioni eterogenee di cellule all’interno del polmone, in particolare le cellule più sensibili designate attraverso studi di patologia microscopica, le cellule epiteliali di tipo I (Adamson 1984; Aso et al. 1976; Jones e Reeve 1978). Sono necessari ulteriori studi per identificare se le differenze nel Blmh sono dovute a una ridotta espressione o a una modalità di azione alternativa.
In alternativa, si può considerare la possibilità che le cellule polmonari esprimano livelli più elevati di un presunto trasportatore BLM. Sebbene questa ipotesi sia coerente con l’incapacità, in vivo, dei polmoni di convertire BLM in dA2, non c’è consenso generale sulla capacità delle cellule polmonari di assumere BLM. È chiaro che BLM dipende dal trasporto attivo per ottenere l’ingresso nella cellula (Poddevin et al. 1991). Utilizzando criceto linea cellulare polmonare e BLM (Pron et al. 1993), è stata identificata una proteina di superficie cellulare di 250 kDa che lega BLM. È interessante notare che il confronto di due linee cellulari umane con diversa suscettibilità BLM ha rivelato che le cellule resistenti a BLM avevano meno siti di legame BLM (Pron et al. 1999). L’identificazione del presunto sistema di trasporto BLM aiuterà a comprendere l’importanza dell’internalizzazione o del metabolismo BLM nella suscettibilità delle cellule polmonari alla tossicità BLM.
Resta da determinare se il meccanismo della tossicità cellulare-selettiva sia una risposta primaria di ridotta espressione di Blmh, ridotta captazione di BLM, o una combinazione dei due, che porta ad un aumento della suscettibilità delle cellule epiteliali alveolari polmonari. Indipendentemente dal meccanismo, è chiaro che il Blmh svolge un ruolo fondamentale nella protezione dalla tossicità del BLM.