CK20 e CK5/6 Colorazione immunoistochimica delle neoplasie uroteliali: una prospettiva

Abstract

Le citocheratine appartengono alla famiglia dei filamenti intermedi. Sono espressi in modo altamente specifico nelle cellule epiteliali dove svolgono un ruolo cruciale nell’integrità e nella stabilità meccanica delle cellule. Diversi tipi di citocheratine sono stati descritti in urotelio normale e neoplastico. Nel caso di neoplasie uroteliali l’espressione di CK20 e CK5/6 ha dimostrato in diversi studi di avere implicazioni diagnostiche e prognostiche. Pertanto, il carcinoma uroteliale di basso grado manifesta l’espressione di CK limitata alle cellule ombrello, mentre i tumori di alto grado di solito hanno un’espressione nell’intero spessore dell’urotelio ad eccezione dello strato basale. L’espressione di CK5/6 d’altra parte è espressa nelle cellule basali in tutti i carcinomi uroteliali di basso grado e in alcuni di alto grado. La colorazione diffusa di CK20 accompagnata dalla perdita dello strato basale positivo di CK5/6 è solitamente associata a un comportamento clinico aggressivo. La doppia colorazione dei vetrini per queste citocheratine può facilitare la corretta interpretazione e correlazione.

1. Introduzione

Le citocheratine appartengono alla famiglia del citoscheletro a filamento intermedio da 10 nm presente in tutte le cellule. Le proteine del filamento intermedio sono espresse in modo altamente specifico per il tipo di cellula, e qui le cheratine rappresentano la tipica categoria di filamenti intermedi presente nelle cellule epiteliali. Questi filamenti sono un gruppo complesso di polipeptidi insolubili in acqua, di dimensioni variabili da 40.000 a 68.000 Mr. Negli epiteli, i filamenti di cheratina possono essere raggruppati come tonofilamenti, intrecciare il nucleo, attraversare il citoplasma e attaccarsi alle placche citoplasmatiche delle tipiche giunzioni cellule-cellule epiteliali, i desmosomi. Pertanto, le cheratine svolgono un ruolo funzionale importante nell’integrità e nella stabilità meccanica sia delle singole cellule epiteliali che di quelle dei tessuti epiteliali e sono una parte intrinseca del continuum di stabilità dalla singola cellula alla formazione del tessuto .

Le proteine della cheratina possono essere suddivise in piccole cheratine acide di tipo I e grandi cheratine da base a neutre di tipo II. Una proprietà unica delle cheratine è che, a differenza delle altre proteine del filamento intermedio, possono costituire il loro stadio filamentoso solo per formazione di coppia di molecole di tipo I e tipo II (1 : 1). Tra le cheratine umane, la recente nomenclatura di consenso comprende le cheratine di tipo I K9–K10, K12–K28 e K31–K40 e le cheratine di tipo II K1–K8 e K71-K86. Nel genoma umano, i geni della cheratina sono raggruppati in due diversi siti cromosomici: cromosoma 17q21.2 (cheratine di tipo I, eccetto K18) e cromosoma 12q13.13 (cheratine di tipo II e K18). Si pensa che le due sottofamiglie della citocheratina siano sorte attraverso la duplicazione genica e la successiva divergenza di CK8 e CK18 .

Ogni tipo di cellula epiteliale esprime una combinazione caratteristica da due a dieci isotipi di citocheratina. Pertanto, le normali cellule epiteliali in vivo o in vitro possono essere identificate rispetto al loro profilo isotipo di citocheratina. I profili caratteristici della citocheratina dei diversi tipi di cellule epiteliali normali tendono ad essere mantenuti dopo la trasformazione neoplastica e questa caratteristica può essere sfruttata nella diagnosi del tumore. Tuttavia, i profili della citocheratina delle cellule epiteliali possono anche riflettere la differenziazione funzionale, piuttosto che il tessuto di origine. Pertanto, le cellule metaplastiche esprimono le caratteristiche del profilo della citocheratina della loro morfologia piuttosto che quella della loro controparte normale .

2. Espressione della citocheratina nell’urotelio durante lo sviluppo embriologico

Le citocheratine sono il primo tipo di filamento intermedio ad apparire durante l’embriogenesi e tutte le cellule ad un certo stadio dello sviluppo fetale sono positive alla citocheratina. I primi isotipi di citocheratina da esprimere sono la coppia CK8 + CK18. Durante la trasformazione embriologica epiteliale-mesenchimale, l’espressione della citocheratina viene persa da alcuni lignaggi di cellule, che rimangono negativi alla citocheratina e si sviluppano in tessuto connettivo o in seguito ri-esprimono citocheratine di epiteli secondari . Lo sviluppo embriologico della vescica urinaria proviene dalla cloaca, una struttura hindgut, che è una camera comune per i rifiuti gastrointestinali e urinari. Nella 4a–7a settimana di sviluppo, la cloaca è divisa dal setto urorettale in due parti: canale anorettale posteriore e seno urogenitale anteriore. La parte superiore del seno urogenitale forma la vescica urinaria .

Durante lo sviluppo precoce della vescica, l’epitelio di rivestimento si trasforma gradualmente da semplice epitelio endodermico a rivestimento uroteliale multistrato. Come modello del rivestimento endodermico nel tratto GASTROINTESTINALE, il rivestimento uroteliale in via di sviluppo è inizialmente diffusamente positivo per CK20 in tutti gli strati. Durante la successiva maturazione dell’urotelio, si sviluppa uno strato basale che può essere dimostrato dalla positività di CK5 e CK13. L’ulteriore maturazione dell’urotelio comporta la perdita di CK20 praticamente in tutti gli strati ad eccezione delle cellule ombrello. Così, ci sembrano essere tre fasi distinte di sviluppo uroteliale. Il primo stadio è caratterizzato da una mancanza di cellule basali e dall’espressione di CK20 in tutti gli strati. La seconda fase è determinata dall’aspetto dello strato basale, ma il modello di espressione CK20 è ancora diffuso. Nella terza e ultima fase, c’è maturazione del modello di espressione CK20 che è caratterizzato da CK20 solo nello strato ombrello. Lo strato basale è ben sviluppato e può essere dimostrato da immunocontenenti CK5/6 o CK13 .

3. Espressione della citocheratina nell’urotelio normale

La vescica urinaria è rivestita dall’urotelio che è specializzato per funzionare come barriera all’urina e per accogliere i cambiamenti nel volume intraluminale. L’urotelio appare come un epitelio multistrato, con tre zone cellulari: (1) uno strato di cellule basali composto da cellule a contatto e orientate perpendicolarmente al piano della membrana basale; (2) la zona cellulare intermedia composta da 2-5 strati cellulari; (3) uno strato cellulare luminal o superficiale composto da cellule intermedie tardive e grandi, spesso binucleate, cellule “ombrello” con la loro superficie apicale rivolta verso il lume. Le cellule ombrello sono caratterizzate da un tipo zonula occludens di giunzioni cellulari e dalla presenza di placche specializzate della membrana unitaria asimmetrica nella membrana cellulare apicale e all’interno di vescicole fusiformi intracellulari . Questo aspetto è dovuto alla presenza di uroplakin abbondante all’interno della membrana cellulare .

Nell’urotelio adulto normale, CK7, CK8, CK18 e CK19 sono espressi in tutti gli strati di cellule uroteliali, CK5 è espresso basalmente e CK20 è associato a cellule ombrello (Figura 1).

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Figura 1

(a) Normale urotelio rivelando più strati di cellule, comprese le cellule basali, cellule intermedie, ombrello e cellule. (b) Macchia immunoistochimica che rivela il normale schema di colorazione dell’urotelio. Le celle ombrello sono decorate da CK20 (magenta). Le cellule intermedie non sono colorate. Le cellule basali sono decorate dalla colorazione CK5 / 6 (marrone).

Ci possono anche essere alcune cellule CK20-positive nello strato intermedio delle cellule di alcuni campioni normali .

4. Espressione della citocheratina nella neoplasia uroteliale papillare

La trasformazione neoplastica delle cellule uroteliali dà origine al carcinoma uroteliale, la forma più comune di cancro alla vescica nella maggior parte dei paesi. Molti pazienti presentano tumori superficiali che sono non invasivi (pTa) o invadono solo la lamina propria (pT1). Mentre la recidiva è comune (50-70%), la malattia di solito può essere controllata dal trattamento locale. Tuttavia, il 10-15% dei pazienti con malattia superficiale alla fine progredisce verso la malattia muscolo-invasiva e metastatica. Un aumento del grado, caratterizzato da una perdita di differenziazione e la presenza di cambiamenti displastici sono entrambi determinanti della prognosi infausta. Inoltre, alcuni carcinomi uroteliali mostrano differenziazione basale / squamosa, che è stata associata a prognosi peggiore .

Il pattern di colorazione immunoistochimica per citokeratin20 e CK5/6 varia con il tipo e la natura della neoplasia uroteliale. Ad esempio, neoplasie uroteliali papillari a potenziale maligno limitato (PUNLMP) e carcinomi papillari di basso grado rivelano CK20 limitato alle cellule ombrello e colorazione CK5/6 limitata allo strato basale, identica alla distribuzione di queste cheratine nell’urotelio normale (Figura 2).

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Figura 2

(a) di Basso grado papillare carcinoma uroteliale. (b) Macchia immunoistochimica raffigurante l’espressione CK20 (magenta) limitata alle cellule ombrello e uno strato basale ben formato raffigurato dalla colorazione CK5/6 (marrone). (c) Carcinoma uroteliale di basso grado con colorazione delle cellule basali ma privo di cellule ombrello.

I carcinomi uroteliali di alta qualità, d’altra parte, tendono ad avere un’immunoreattività diffusa per CK20 che coinvolge le cellule ombrello e lo strato intermedio. Inoltre, lo strato basale può essere dimostrato dalla positività CK5/6 (Figura 3).

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Figura 3

(a) di Alta qualità papillare carcinoma uroteliale. b) Carcinoma uroteliale papillare di alto grado con colorazione diffusa a tutto spessore per CK20 e presenza di strato basale come dimostrato dalla colorazione CK5/6. (c) Carcinoma uroteliale di alta qualità che rivela la presenza diffusa di cellule basali e colorazione a tutto spessore per CK20.

Il carcinoma uroteliale papillare di grado superiore, d’altra parte, rivela l’espressione di CK20 nell’intero spessore dell’urotelio con l’assenza di strato basale e colorazione negativa per CK5/6 (Figura 4).

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Figura 4

(a) di Alta qualità di carcinoma uroteliale con parziale perdita di cellule basali, ma colorazione diffusa per CK20. (b) Carcinoma uroteliale di alta qualità con perdita quasi completa di cellule basali. c) Carcinoma uroteliale papillare di alta qualità che rivela una colorazione immunoistochimica diffusa per CK20 e completa assenza di strato basale senza colorazione per CK5/6.

Questo pattern con colorazione diffusa a pieno spessore CK20 in assenza di colorazione dello strato basale è anche una caratteristica riscontrata nei carcinomi uroteliali di alto grado con lamina propria o invasione muscolare (Figura 5).

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Figura 5

(a) di Alta qualità di carcinoma uroteliale con i primi invasione mostrando forte CK20 colorazione citoplasmatica e l’assenza di cellule basali. (b) Carcinoma uroteliale di alta qualità con estesa invasione. Le cellule del carcinoma sono diffusamente positive per CK20, ma lo strato basale è assente.

È stato suggerito che il modello di colorazione CK20 è un utile complemento alla morfologia nella diagnosi di carcinoma uroteliale. È stato anche suggerito che l’espressione di CK20 può predire il potenziale maligno nei tumori uroteliali di basso grado e, pertanto, CK20 può essere utile nella definizione di strategie di trattamento per i pazienti con questi tumori. L’espressione di CK20 è stata mantenuta dalla maggior parte dei carcinomi uroteliali puri, mantenendo il normale modello di localizzazione superficiale in alcuni tumori papillari ben differenziati o mostrando una reazione eterogenea o uniformemente positiva in tutti gli strati cellulari. Porzioni del carcinoma con differenziazione squamosa rivelano una riduzione dell’espressione di CK20. Queste aree, tuttavia, reagiscono positivamente per CK5 / 6(Figure 6(a) e 6 (b)) in un modello diverso dalla distribuzione basale dello strato basale .

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Figura 6

(a) di Alta qualità di carcinoma uroteliale con focale differenziazione squamosa. (b) Colorazione immunoistochimica che dimostra una forte colorazione CK5/6 nell’area della differenziazione squamosa. La parte rimanente delle macchie di carcinoma per CK20. (c) Carcinoma uroteliale di alto grado con caratteristiche morfologiche basosquamose. (d) Colorazione immunoistochimica nel carcinoma basosquamous che caratterizza il forte immunostaining per CK5/6 e l’assenza completa di positività CK20.

In alcuni casi, l’intero carcinoma può mostrare caratteristiche basosquamose. Questi casi mostrano una forte reattività per CK5 / 6 con poca o nessuna positività per CK20(Figure 6(c) e 6 (d)).

Due studi pubblicati di recente hanno fornito ulteriori prove sul significato clinico di vari modelli di immunostenenti per CK20 e CK5/6. In uno di questi studi, sono stati analizzati campioni tumorali di 222 pazienti con carcinomi uroteliali del tratto superiore trattati con nefroureterectomia radicale per l’espressione di sette marcatori immunoistochimici basali/luminali (CK5, EGFR, CD44, CK20, p63, GATA3 e FOXA). Utilizzando CK5 e CK20, hanno definito quattro sottotipi di carcinomi uroteliali del tratto superiore:(i)Esclusivamente CK20 positivo e CK5 negativo (CK20+/CK5−)(ii)Esclusivamente CK5 positivo e CK20 negativo (CK20−/CK5+)(iii)Entrambi gli indicatori positivi (CK20+/CK5+)(iv)Sia marker negativi (CK20−/CK5−)

multivariata di regressione di Cox analisi, la CK20+/CK5− sottotipo indipendente prognostico negativo marcatore con una 3.83-fold aumento del rischio di cancro-specifica di morte rispetto agli altri tre sottotipi .

In un secondo studio, la colorazione immunoistochimica per CK5/6 e CK20 è stata correlata con la prognosi del carcinoma uroteliale precoce. Inoltre, i profili di espressione genica di sottogruppi di carcinoma uroteliale del tratto superiore non muscolo-invasivo papillare di alto grado (UTUC) classificati per livelli di espressione CK5/6 e CK20 sono stati studiati e correlati con gli esiti clinici. Questi sottogruppi includevano CK5 / 6-high / CK20-low, CK5/6-high/CK20-high e CK5/6-low/CK20-high. Quest’ultimo gruppo caratterizzato da bassa espressione di CK5/6 e alta espressione di CK20 era predittivo di prognosi peggiore di carcinomi uroteliali papillari non invasivi di alto grado. L’analisi trascrizionale ha rivelato 308 geni espressi in modo differenziale tra i sottogruppi. Le analisi funzionali dei geni hanno identificato l’adesione cellulare come un processo comune arricchito in modo differenziato in questo sottogruppo rispetto agli altri, il che potrebbe spiegare il suo fenotipo ad alto rischio. Anche le firme tardive del ciclo cellulare / proliferazione sono state arricchite in questo sottogruppo . Pertanto, sembra che i tumori uroteliali caratterizzati da colorazione diffusa per CK20 in assenza di strato basale dimostrabile rappresentino il sottotipo più aggressivo del carcinoma uroteliale papillare.

La citocheratina 5/6 è presente nella normale epidermide cheratinizzante e nell’epitelio squamoso della mucosa, nonché nelle cellule basali o nelle cellule mioepiteliali del seno, delle ghiandole salivari e della prostata . Nelle biopsie prostatiche e mammarie, la CK5 / 6 decora lo strato delle cellule basali e quindi è utile nella diagnosi di carcinoma invasivo, essendo quest’ultimo privo di cellule basali. L’architettura dell’urotelio è diversa da quella dell’epitelio duttale prostatico o mammario con il risultato che la presenza o l’assenza di cellule basali non può essere utilizzata per stratificare le neoplasie uroteliali in tipi benigni o maligni. Tuttavia, l’assenza di cellule basali nelle neoplasie uroteliali può indicare una prognosi infausta. Pertanto, un carcinoma uroteliale di alto grado con uno strato basale conservato può comportarsi in modo meno aggressivo rispetto a un altro tumore di alto grado in cui lo strato basale è stato perso. Nel nostro laboratorio, usiamo doppia colorazione per queste citocheratine che è estremamente utile nella corretta interpretazione di queste macchie.

Un modello di colorazione simile può essere visto anche nel carcinoma uroteliale in situ . Queste lesioni sono di solito fortemente reattive per CK20 e possono o non possono mantenere lo strato di cellule basali CK5/6-positivo. Il tipo aderente di carcinoma uroteliale in situ e l’estensione pagetoide delle cellule di carcinoma possono anche essere riconosciuti dalla colorazione CK20 positiva (Figura 7).

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Figura 7

(a) carcinoma Uroteliale in situ con forte spessore immunocolorazione per CK20, con una netta strato basale delle cellule positive per CK5/6. (b) Un altro carcinoma uroteliale in situ con forte colorazione per CK20 e assenza di strato basale. c) Estensione pagetoidea del carcinoma uroteliale dimostrata da una forte colorazione citoplasmatica per CK20 in uno sfondo di più strati di cellule basali reattive per CK5/6.

In una minoranza di casi, il carcinoma in situ può essere reattivo per CK5 / 6 indicando una differenziazione basaloide .

5. Differenziazione uroteliale embriologica contro dedifferenziazione nella neoplasia uroteliale

La stretta correlazione tra i modelli di espressione dell’isotipo della citocheratina e la differenziazione epiteliale suggerisce che le citocheratine sono cruciali per la struttura e/o la funzione del tessuto epiteliale. Tuttavia, è stato difficile stabilire quali siano i contributi precisi di individui o combinazioni di isotipi di citocheratina al fenotipo e al comportamento delle cellule epiteliali normali e neoplastiche. Pertanto, i cambiamenti nell’immunolocalizzazione CK20 che indicano un rischio più elevato di recidiva del carcinoma uroteliale probabilmente riflettono un cambiamento secondario correlato alla disregolazione del programma di differenziazione uroteliale durante la carcinogenesi piuttosto che indicare che CK20 è direttamente coinvolto. Si può ipotizzare che i modelli di espressione di CK20 e CK5/6 in vari carcinomi uroteliali tendano a imitare le fasi dello sviluppo embriologico e della differenziazione dell’urotelio. Pertanto, i carcinomi uroteliali di alto grado (con o senza invasione) che sono caratterizzati da un’espressione diffusa di CK20 senza alcun strato basale possono rappresentare lo stadio iniziale della differenziazione uroteliale dopo che il seno urogenitale si separa dalla cloaca . Durante questa fase di sviluppo, l’urotelio manifesta una colorazione diffusa di CK20 ma manca di uno strato basale. In alcuni dei carcinomi uroteliali di alta qualità, c’è una colorazione uniforme di tutti gli strati di CK20, ma c’è anche uno strato basale ben formato dimostrabile dall’espressione di CK5/6. Questo può essere equivalente allo stadio intermedio della differenziazione uroteliale embrionale. I carcinomi uroteliali ben differenziati sono caratterizzati dalla presenza di un pattern maturo di espressione CK20 dove la sua espressione è per lo più limitata alle cellule ombrello, mentre è presente anche uno strato di cellule basali ben definito immunoreattivo per CK5/6 (Figure 8 e 9).

Figura 8

(a) Cartone animato raffigurante fasi di differenziazione durante lo sviluppo embriologico dell’urotelio. Durante le fasi iniziali, l’urotelio in via di sviluppo mantiene l’espressione CK20 normalmente vista nella cloaca. Durante questa fase, non è presente nessuno strato basale. b) Durante lo sviluppo dell’urotelio, lo strato basale non può essere dimostrato mediante colorazione per CK5/6. (c) Stadio finale di differenziazione uroteliale con espressione normale di CK20 limitata alle cellule ombrello e presenza di uno strato basale normale che manifesta l’espressione di CK5/6.

Figura 9

(a) Cartone animato raffigurante colorazione immunoistochimica in un carcinoma uroteliale papillare di basso grado con espressione CK20 limitata alle cellule ombrello e presenza di uno strato basale ben definito che esprime CK5/6. b) Il carcinoma uroteliale di alta qualità rivela l’espressione di CK20 in tutti gli strati di urotelio ad eccezione dello strato basale che contiene CK5/6. Questo può rappresentare uno stadio intermedio di dedifferenziazione del tumore. (c) Nel carcinoma uroteliale di alto grado, lo strato basale può essere assente, ma viene mantenuto il modello diffuso di colorazione CK20. Queste caratteristiche possono indicare un’ulteriore dedifferenziazione del carcinoma.

Questo modello può essere equivalente allo stadio finale dello sviluppo e della maturazione uroteliale durante il periodo intrauterino.

In sintesi, la colorazione immunoistochimica del carcinoma uroteliale per CK20 e CK5/6 può fornire informazioni utili sulla natura del carcinoma uroteliale e sul suo comportamento clinico.

Disponibilità dei dati

Non sono stati utilizzati dati a supporto di questo studio.

Conflitti di interesse

Gli autori dichiarano di non avere finanziamenti o conflitti di interesse da divulgare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano riconoscere la preziosa assistenza e la competenza tecnica dei seguenti supervisori e tecnici del nostro laboratorio immunoistochimico nell’esecuzione della colorazione immunoistochimica bicolore: LA SIGNORA Rajaa Al Abdulla, supervisore; la SIGNORA Huda Ahmed Al Hijji, supervisore; e la SIGNORA Zuhoor Ali, tecnologo senior.