Cisplatino ototossicità comporta citochine e STAT6 rete di segnalazione

Reagenti

Cisplatino e 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenil-tetrazolium bromuro (MTT) sono stati acquistati dalla Sigma Chemical Co (Sigma, st. Louis, MO, USA). I materiali di coltura plastica sono stati acquistati da Becton Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA). Il mezzo essenziale modificato di Dulbecco (DMEM), il siero bovino fetale (FBS, Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) e altri reagenti di coltura tissutale sono stati ottenuti da Life Technologies Inc. (Gaithersburg, MD, USA). La proteina IL-4 e IL-13 del topo ricombinante, gli anticorpi contro IL-4, IL-13, TNF-α, IL-1β, IL-6 ed i corredi collegati enzima (ELISA) dell’analisi dell’immunosorbente (QuantikineR) per le citochine sono stati acquistati da R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, USA). Questi anticorpi sono stati utilizzati per l’immunoistochimica ad una concentrazione di 1: 200. Gli anticorpi contro p-STAT4, STAT4, p-STAT6, STAT6, NF-kB (p65) e IkB sono stati acquistati da Santa Cruz Biotech Inc. (Santa Cruz, CA, USA).

Coltura cellulare e vitalità

L’istituzione e la caratterizzazione delle cellule uditive HEI-OC1 condizionatamente immortalate sono state descritte nel nostro precedente rapporto 1. L’espressione di marcatori OHC specifici come Math1 e Miosina 7a suggerisce che le cellule HEI-OC1 rappresentano precursori OHC. Le cellule HEI-OC1 sono state mantenute in DMEM ad alto glucosio (Gibco BRL) contenente il 10% di FBS. Per gli esperimenti descritti di seguito, le cellule HEI-OC1 sono state coltivate nelle seguenti condizioni permissive: 33 °C e 5% CO2 in DMEM integrato con 10% FBS. Le cellule (3 × 104 cellule / pozzetto di una piastra da 24 pozzetti) sono state incubate con 20 µM cisplatino per 24 h. Per determinare la vitalità cellulare, MTT (0,25 mg) è stato aggiunto a una sospensione cellulare da 1 ml per 4 h. Dopo aver lavato le cellule e tre lavaggi con PBS (pH 7,4), il prodotto formazan insolubile è stato sciolto in DMSO. La densità ottica (OD) di ciascun pozzo di coltura è stata quindi misurata utilizzando un lettore di micropiastre (Titertek Multiskan, Flow Laboratories) a 590 nm. Il OD delle celle di controllo è stato preso per indicare la vitalità 100%. Per esaminare gli effetti di varie citochine, anticorpi neutralizzanti contro le citochine sono stati aggiunti alle culture per 30 min, dopo di che sono stati colti con 20 µM cisplatino per 24 h.

Animali

STAT4−/− (backcross generazione N10), STAT6−/− (backcross generazione N6), e WT topi BALB/c sono stati acquistati da Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). I topi omozigoti STAT4 e STAT6 KO sono stati identificati mediante PCR. I topi KO non hanno mostrato alcuna anomalia dello sviluppo. Gli esperimenti sono stati eseguiti in topi di 6 settimane e tutti i topi sono stati abbinati all’età entro 3 giorni. I topi sono stati alimentati con una dieta commerciale standard mentre alloggiavano a una temperatura ambiente di 20-22 °C e un’umidità relativa di 50 ± 5% sotto un ciclo di luce:buio 12:12 h in una struttura specifica priva di agenti patogeni. Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal comitato per la cura e l’uso degli animali presso la Wonkwang University School of Medicine.

Analisi del reporter della luciferasi

Le cellule sono state transitoriamente trasfettate con il plasmide del reporter della luciferasi di NF-kB usando il reagente della trasfezione, Lipofectamine 2000. Dopo 36 h di incubazione, le cellule sono state trattate con cisplatino per 12 h in presenza di anticorpi neutralizzanti citochine. Le cellule sono state quindi lavate due volte con buffer PBS e successivamente lisate in buffer di lisi reporter (Promega, Madison, WI, USA). Un’aliquota di 20 µl del lisato è stata quindi miscelata con 100 µl di reagente del saggio di luciferasi, dopo di che l’intensità della luce emessa è stata misurata utilizzando un luminometro AutoLumat LB953 (ad esempio e G Berthold, Bad Wildbad, Germania). Infine, l’attività della luciferasi è stata misurata in triplice copia, media e quindi normalizzata contro l’attività della β-galattosidasi utilizzando il sistema di analisi della galattosidasi (Galacto-Light, Tropix Inc., MA, USA) secondo le istruzioni del produttore.

Trasfezione con costrutti siRNA

siRNA Predesigned contro mouse STAT4, STAT6 e controllo scrambled siRNA sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology. I fili di senso di siRNA contro STAT4 e STAT6 sono i seguenti. Il costrutto STAT4 siRNAs è un pool di tre sequenze di siRNA come segue: Duplex 1 senso Strand: 5 ‘- IndexTermGUA GCU GUG GUA AUU UCA A-3′, Duplex 2 senso Strand: 5′-IndexTermCUA CCU UCC UGA UCU ACA A-3′, e Duplex 3 senso Strand: 5’-IndexTermCUG UCG UGA UGA UUU CUA A-3 ‘ (mRNA accession number: NM_011487). Il costrutto STAT6 siRNAs è un pool di tre sequenze di siRNA come segue: Duplex 1 senso Strand: 5 ‘- IndexTermGAU GCU UUC UGU UAC AAC A-3′, Duplex 2 senso Strand: 5′-IndexTermCUA GCC UUC UCC UCA AUG A-3′, e Duplex 3 senso Strand: 5’-IndexTermGUC UCU ACU ACU AUC AAG A-3 ‘ (mRNA accession number: NM_009284). Le cellule sono state transitoriamente trasfettate con 100 nM di costrutti siRNA nel reagente di trasfezione siRNA X-tremeGENE (Roche Applied Science, Penzberg, Germania) secondo il protocollo del produttore. Dopo l’incubazione a 33 °C e 5% di CO2 per 36 h, le cellule sono state ulteriormente trattate con cisplatino per 24 h. I campioni sono stati quindi preparati e analizzati per l’analisi della vitalità o Western blot. L’interferenza dell’espressione è stata confermata dall’analisi immunoblot.

Misurazione delle citochine proinfiammatorie mediante ELISA

Per misurare la secrezione di citochine proinfiammatorie dalle cellule trattate con cisplatino, i surnatanti di coltura sono stati raccolti ad ogni punto temporale e i livelli di citochine proinfiammatorie secrete sono stati poi determinati mediante ELISA (Quantikine Cytokine Kits; R&D Systems Inc.) secondo le istruzioni del produttore.

Preparazione della citosolico e estratti nucleari

Cellule sono state lavate con ghiaccio-freddo PBS, raschiato e centrifugati a 1 000 x g per 5 min a 4 °C. Il pellet cellulare è stato poi risospeso in 200 µl di tampone di lisi (10 mM HEPES, pH 7.9, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM phenylmethylsulfonyl fluoro, e 0.5 mM ditiotreitolo) e poi incubati in ghiaccio per 15 min. Alla fine dell’incubazione, sono stati aggiunti 10 µl di NP-40 al 10% e il tubo è stato vorticato per 10 s. Dopo centrifugazione a 13 000× g per 1 min a 4 °C, il surnatante (estratto citosolico) è stato raccolto e conservato a -80 °C, mentre il pellet è stato ulteriormente lavorato per ottenere gli estratti nucleari. Il pellet è stato quindi risospeso in tampone di estrazione (5 mm HEPES, pH 7,9, 1,5 mm MgCl2, 0,5 mM fenilmetilsolfonil fluoruro, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitolo e 25% (vol/vol) glicerolo) e incubato per 30 min a 4 °C. Gli estratti nucleari sono stati isolati per centrifugazione a 13 000× g per 30 min a 4 °C. Il surnatante è stato quindi rimosso e conservato a -80 ° C fino all’utilizzo per l’analisi western blot. Infine, la concentrazione proteica è stata determinata dal metodo Lowry.

Analisi Western blot

L’analisi Western blot è stata eseguita come segue. In breve, le cellule sono state raccolte e lavate due volte con PBS ghiacciato. I lisati frazionati totali e nucleari / citosolici sono stati quindi sottoposti ad elettroforesi su gel 12% SDS-poliacrilammide per 3 h a 20 mA, dopo di che sono stati trasferiti alla nitrocellulosa. La membrana è stata quindi incubata nel 5% (peso/vol) il latte in polvere di proteine in PBS contenente 0.05% (vol/vol) Tween-20 (PBS-T) per 1 h, dopo di che sono stati lavati in PBS-T, e poi ha reagito con anticorpo primario (1:1 000) per 1 h. A quel punto, la membrana è stata ampiamente lavati con PBS-T e quindi incubate con anti-rabbit IgG coniugato con HRP (1:3 000 euro) per 1 h. Dopo numerosi lavaggi, bande di proteine di membrana sono stati visualizzati mediante chemiluminescenza reagenti secondo le istruzioni del produttore (Supersignal Substrato; Pierce, Rockford, IL, USA).

Esperimento in vivo di ototossicità del cisplatino

Tutti i topi sono stati divisi casualmente in due gruppi di sei topi ciascuno. Gli animali del gruppo 1, che erano considerati un gruppo di controllo, hanno ricevuto un’iniezione intraperitoneale di PBS. Agli animali del gruppo 2 è stato somministrato cisplatino (4 mg/kg di peso corporeo) per iniezione intraperitoneale per 4 giorni consecutivi. Gli animali sono stati quindi uccisi sotto anestesia usando gas CO2 il giorno successivo all’iniezione finale di cisplatino, dopo di che è stato rimosso l’osso temporale dell’orecchio destro.

Misurazione dell’ABR

Per ulteriori analisi della soglia uditiva, l’ABR è stato misurato prima e 24 ore dopo il trattamento finale di cisplatino. Sono state quindi confrontate le variazioni della soglia ABR tra pre-trattamento e post-trattamento. I topi sono stati anestetizzati usando un cocktail di ketamina (40 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e tenuti al caldo con una piastra elettrica durante la registrazione ABR. Un elettrodo ad ago subdermico (attivo) è stato inserito al vertice, mentre gli elettrodi di terra e di riferimento sono stati inseriti subdermicamente nella pelle flaccida sotto le pinnae delle orecchie opposte. Gli stimoli di prova consistevano in raffiche di tono di fase alternate a frequenze di 4, 8, 16 e 32 kHz. I segnali sono stati generati utilizzando Tucker Davis Technologies (TDT, Gainesville, FL, USA) SigGen software. Ogni burst tono (durata 1 ms) è stato gated attraverso una finestra Blackmann, e aveva un tempo di salita-caduta di 0,5 ms senza plateau. Gli stimoli sono stati calibrati prima di ogni sessione di test, registrando l’uscita dell’altoparlante con un microfono posto a livello della testa degli animali. Le forme d’onda ABR sono state calcolate in media in risposta a 300 raffiche di tono ad ogni frequenza testata. Ad ogni frequenza, l’ampiezza del segnale veniva automaticamente attenuata in passi di 10 dB da 90 dB SPL fino a quando le onde ABR scomparivano in tracce registrate con impostazioni del filtro di 100-3 000 Hz. Il giudizio della soglia è stato reso off-line da due osservatori indipendenti, sperimentalmente ciechi sulla base dei record ABR.

Preparazione superficiale dell’organo di Corti explants

Tutti i topi sono stati uccisi il giorno dopo l’iniezione finale di cisplatino. L’osso temporale è stato sezionato e fissato in 4% paraformaldeide per 16 ore a 4 °C e risciacquato con 0,1 M PBS. L’osso temporale è stato ulteriormente decalcificato con EDTA al 10% in PBS per 3 giorni. La coclea è stata accuratamente sezionata. Successivamente, la stria vascularis e il legamento a spirale sono stati sezionati, lasciando l’organo di Corti. Il giro centrale della coclea è stato immerso in falloidina etichettata con TRITC (Sigma P1951, 1:100) in PBS per 20 min. Dopo tre lavaggi con PBS, il campione è stato esaminato al microscopio a fluorescenza utilizzando filtri appropriati per TRITC (eccitazione: 510-550 nm, emissione: 590 nm).

Colorazione immunoistochimica e test TUNEL

L’osso temporale rimosso è stato fissato in 4% paraformaldeide per 16 ore e poi decalcificato con 10% EDTA in PBS per 2 settimane, dopo di che è stato disidratato e incorporato in cera di paraffina. Sezioni di 5 µm sono state deparaffinizzate in xilene e reidratate attraverso concentrazioni graduate di etanolo. Per lo studio di immunoistochimica, è stato utilizzato un kit di immunoistochimica (DAKO LSAB Universal K680, Carpinteria, CA, USA) e le procedure sono state condotte secondo le istruzioni del produttore. La perossidasi endogena è stata quindi bloccata con perossido di idrogeno al 3% per 5 min a temperatura ambiente (RT). Dopo le sezioni sono state lavate in PBS, il legame è stato bloccato con 1% di albumina di siero bovino per 1 h. Primaria anticorpi (1:200 diluito) sono stati poi aggiunti alle diapositive, dopo che l’incubazione è proceduto per 1 h. Dopo ripetuti lavaggi con PBS, le sezioni sono state incubate con l’anticorpo secondario biotinilato per 30 min e poi coperto per 30 min con un anticorpo secondario contenente perossidasi di rafano. Infine, le sezioni sono state colorate in una soluzione di substrato appena preparata (3 mg di 3-ammino-9-etilcarbazolo in 10 ml di tampone di acetato di sodio (pH 4,9), 500 µl di dimetilformammide, perossido di idrogeno allo 0,03%) per 5 min. I nuclei delle cellule immuno-colorate sono stati poi contrastati con l’ematossilina di Mayer(Sigma-Aldrich Co.). Le cellule apoptotiche sono state rilevate in situ utilizzando il test TUNEL (TUNEL POD kit, Roche Molec Biochemic, Mannheim, Germania). In breve, una sezione è stata deparaffinizzata e reidratata. Dopo l’incubazione con 20 µg/ml di proteinasi K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germania), la perossidasi endogena è stato bloccato da incubando i campioni in il 2% di H2O2 in metanolo per 30 min a RT. A quel punto, le sezioni di tessuto sono state lavate in PBS e incubate con una soluzione di etichettatura per 1 h a 37 °C. I nuclei sono stati poi sottoposto a colorazione di contrasto con ioduro di propidium (0.5 µg/ml, Sonde Molecolari) per 10 min a RT. Dopo lavaggi con PBS, il campione è stato esaminato con un microscopio a fluorescenza.

Amplificazione inversa della trascrittasi-PCR

Per la PCR cocleare, l’osso temporale dell’orecchio sinistro è stato rapidamente raccolto e immerso in RNAlater (Ambion, Inc., Austin, TX, USA) fino all’uso a -20 °C. Quindi, le coclee intere sono state sezionate e utilizzate per estrarre l’RNA totale mediante l’uso di TRIzol (Invitrogen) secondo i protocolli del produttore. Dopo l’estrazione dell’RNA totale usando Trizol (Invitrogen), il cDNA a filamento singolo è stato sintetizzato dall’RNA totale. Successivamente, la PCR con Taq DNA polimerasi (Takara, Takara Shuzo, Giappone) è stata eseguita sottoponendo i campioni a 30 cicli di 95 °C per 40 s, 58 °C per 40 s e 72 °C per 50 s. Dieci microlitri dei prodotti PCR sono stati quindi separati su gel di agarosio all ‘ 1,2% e visualizzati sotto luce UV. Le sequenze dei primer utilizzati per l’amplificazione della PCR erano le seguenti: GAPDH (forward, 5′-IndexTermGGG TGT GAA CCA CGA GAA AT-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ATG AGC CCT TCC ACA AT-3′), TNF-α (forward, 5′-IndexTermCAG GGG CCA CCA CGC TCT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermCTT GGG GCA GGG GCT CTT GAC-3′), IL-1β (forward, 5′-IndexTermAAG GAG ACC AAG CAA CGA C-3′, reverse, 5′-IndexTermGAG ATT GAG CTG TCT GCT CA-3′), IL-2 (forward, 5′-IndexTermGTC AAC AGC GCA CCC ACT TCA AGC-3′, reverse, 5′-IndexTermGCT TGT TGA GAT GAT GCT TTG ACA-3′), IL-4 (forward, 5′-IndexTermACG GAG ATG GAT GTG CCA AAC GTC-3′, reverse, 5′-IndexTermCGA GTA ATC CAT TTG CAT GAT GC-3′), IL-5 (forward, 5′-IndexTermGCT CCT TCA GGA ATC TGT TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGGC TCA TGTACT TTC ATG AG-3′), IL-6 (forward, 5′-IndexTermTTG CCT TCT TGG GAC TGA TGC-3′, reverse, 5′-IndexTermTTG GAA ATT GGG GTA GGA AGG A-3′), IL-10 (forward, 5′-IndexTermAGA CTT TCT TTC AAA CAA AGG ACC AGC TGG A-3′, reverse, 5′-IndexTermCCT GGA GTC CAG CAG ACT CAA TAC ACA CTG C-3′), IL-12 (forward, 5′-IndexTermACC TCA GTT TGG CCA GGG TC-3′, reverse, 5′-IndexTermGTC ACG ACG CGG GTG GTG AAG-3′), and IFN-γ (forward, 5′-IndexTermTAC TGC CAC GGC ACA GTC ATT GAA-3’, reverse, 5 ‘- IndexTermGCA GCG ACT CCT TTT CCG CTT CCT-3’).

Analisi statistica

Ogni esperimento è stato eseguito almeno tre volte e tutti i valori riportati rappresentano la media ± SD delle analisi triplicate. L’analisi statistica multivariata è stata eseguita mediante analisi dei test di varianza e Duncan, utilizzando il software statistico SPSS 11 (Chicago, IL, USA). ANOVA bidirezionale e / o ANOVA unidirezionale sono stati utilizzati per determinare il significato dei risultati. I risultati statistici sono stati esaminati da un biostatista di livello master. Valori di P < 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi.