Circulating Tumor DNA

Pre-analytical considerationsEdit

Quando il sangue viene raccolto in provette EDTA e conservato, i globuli bianchi iniziano a lisare e rilasciare genomico wild type DNA nel campione in quantità tipicamente molte volte superiore al ctDNA è presente in. Ciò rende più difficile il rilevamento di mutazioni o altri biomarcatori ctDNA. L’uso di provette di stabilizzazione cellulare disponibili in commercio può impedire o ritardare la lisi dei globuli bianchi riducendo così l’effetto di diluizione del ctDNA. Sherwood et al hanno dimostrato un rilevamento superiore delle mutazioni KRAS in campioni abbinati raccolti in provette EDTA K3 e Streck BCT. I vantaggi dei tubi di stabilizzazione cellulare possono essere realizzati in situazioni in cui il sangue non può essere trasformato immediatamente in plasma.

Altre procedure possono anche ridurre la quantità di DNA wild type “contaminante” e rendere più fattibile il rilevamento del ctDNA:

• Non congelare un campione di sangue prima di estrarre il plasma per ctDNA analisi
• Processo di campione plasma entro 2-4 ore (se raccolto in EDTA provetta)
• non utilizzare Mai heparinised tubi, eparina inibisce la PCR imitando la struttura elicoidale del DNA
• Eseguire una doppia fase di centrifugazione (centrifugare il sangue per rimuovere il plasma, poi ripetere sul plasma per rimuovere dai detriti sul fondo del tubo) per rimuovere più detriti cellulari prima dell’estrazione del DNA.
• Il plasma è migliore del siero per il recupero del ctDNA

Estrazione di ctDNAEdit

L’appello principale dell’analisi del ctDNA è che viene estratto in modo non invasivo attraverso la raccolta del sangue. L’acquisizione di cfDNA o ctDNA richiede in genere la raccolta di circa 3 ml di sangue in provette rivestite con EDTA. L’uso di EDTA è importante per ridurre la coagulazione del sangue. Le frazioni di plasma e siero del sangue possono essere separate attraverso una fase di centrifugazione. ctDNA o cfDNA possono essere successivamente estratti da queste frazioni. Sebbene il siero tende ad avere maggiori livelli di cfDNA, questo è principalmente attribuito al DNA dei linfociti. Alti livelli di CFDNA contaminante è sub-ottimale perché questo può diminuire la sensibilità del rilevamento ctDNA. Pertanto, la maggior parte degli studi utilizza il plasma per l’isolamento del ctDNA. Il plasma viene quindi processato nuovamente mediante centrifugazione per rimuovere le cellule del sangue intatte residue. Il surnatante viene utilizzato per l’estrazione del DNA, che può essere eseguita utilizzando kit disponibili in commercio.

Analisi di ctDNAEdit

L’analisi del ctDNA dopo l’estrazione richiede l’uso di vari metodi di amplificazione e sequenziamento. Questi metodi possono essere separati in due gruppi principali in base al fatto che l’obiettivo è quello di interrogare tutti i geni in un approccio non mirato, o se l’obiettivo è quello di monitorare specifici geni e mutazioni in un approccio mirato.

Untargeted approachesEdit

Un intero genoma o interi approcci di sequenziamento esoma può essere necessario per scoprire nuove mutazioni nel DNA tumorale durante il monitoraggio carico di malattia o di monitoraggio della resistenza ai farmaci. Approcci non mirati sono anche utili nella ricerca per osservare l’eterogeneità del tumore o per scoprire nuovi bersagli farmacologici. Tuttavia, mentre i metodi non mirati possono essere necessari in alcune applicazioni, è più costoso e ha una risoluzione inferiore. Ciò rende difficile rilevare mutazioni rare o in situazioni in cui sono presenti bassi livelli di ctDNA (come la malattia residua minima). Inoltre, ci possono essere problemi che distinguono tra DNA da cellule tumorali e DNA da cellule normali utilizzando un approccio intero genoma.

Il sequenziamento dell’intero genoma o dell’esoma utilizza in genere tecnologie di sequenziamento del DNA ad alta velocità. Limitare il sequenziamento a solo l’intero esoma invece può diminuire la spesa e aumentare la velocità, ma a costo di perdere informazioni sulle mutazioni nelle regioni regolatorie non codificanti del DNA. Mentre semplicemente guardando polimorfismi del DNA attraverso il sequenziamento non differenzia il DNA da tumore o cellule normali, questo problema può essere risolto confrontando contro un campione di controllo di DNA normale (ad esempio, il DNA ottenuto attraverso un tampone buccale.) È importante sottolineare che l’intero genoma e il sequenziamento dell’intero esoma sono utili per la scoperta iniziale della mutazione. Questo fornisce informazioni per l’uso di tecniche mirate più sensibili, che possono poi essere utilizzate per scopi di monitoraggio delle malattie.

Il sequenziamento dell’intero genoma consente di recuperare le proprietà strutturali dei cfDNA, le dimensioni dei frammenti e i loro modelli di frammentazione. Questi modelli unici possono essere un’importante fonte di informazioni per migliorare la rilevazione di ctDNA o localizzare il tessuto di origine di questi frammenti. La selezione delle dimensioni di frammenti brevi (<150 bp) con metodi in vitro o in silico potrebbe migliorare il recupero di mutazioni e aberrazioni del numero di copie.

Cariotipo digitaleedit

Questo metodo è stato originariamente sviluppato dal laboratorio di Bert Vogelstein, Luis Diaz e Victor Velculescu presso la Johns Hopkins University. A differenza del normale cariotipo in cui un colorante viene utilizzato per macchiare le bande cromosomiche per visualizzare i cromosomi, il cariotipo digitale utilizza sequenze di DNA di loci in tutto il genoma per calcolare la variazione del numero di copie. Le variazioni del numero di copie sono comuni nei tumori e descrivono situazioni in cui la perdita di eterozigosità di un gene può portare a una diminuzione della funzione a causa di una minore espressione o duplicazione di un gene, che porta alla sovraespressione.

Analisi personalizzata delle estremità riarrangiate (PARE)Edit

Dopo che l’intero genoma è stato sequenziato utilizzando un metodo di sequenziamento ad alto throughput, come Illumina HiSeq, PARE viene applicato ai dati per analizzare i riarrangiamenti cromosomici e le traslocazioni. Questa tecnica è stata originariamente progettata per analizzare il DNA del tumore solido, ma è stata modificata per le applicazioni ctDNA.

Metilazione e idrossimetilazionedit del DNA

La corretta marcatura epigenetica è essenziale per la normale espressione genica e la funzione cellulare e le alterazioni aberranti nei modelli epigenetici sono un segno distintivo del cancro. Uno stato epigenetico normale è mantenuto in una cellula almeno in parte attraverso la metilazione del DNA. La misurazione dei modelli aberranti di metilazione nel ctDNA è possibile a causa della metilazione stabile delle regioni del DNA denominate “isole CpG”. La metilazione del ctDNA può essere rilevata attraverso il trattamento con bisolfito. Il trattamento del bisolfito converte chimicamente le citosine non metilate in un uracile mentre lascia le citosine metilate non modificate. Il DNA viene successivamente sequenziato e possono essere identificate eventuali alterazioni del pattern di metilazione del DNA. L’idrossimetilazione del DNA è un segno similmente associato che è stato indicato per essere un indicatore predittivo delle circostanze sane contro malate in cfDNA, compreso cancro. Misurare i modelli di idrossimetilazione aberranti nel ctDNA è stato dimostrato dai ricercatori dell’Università di Chicago (Chuan He lab,) della Stanford University (Quake lab,) e della società Cambridge Epigenetix.

Approcci mirati

In un approccio mirato, il sequenziamento del ctDNA può essere diretto verso un pannello genetico costruito sulla base di hotspot mutazionali per il cancro di interesse. Ciò è particolarmente importante per informare il trattamento in situazioni in cui le mutazioni sono identificate in bersagli drogabili. Personalizzare l’analisi mirata di ctDNA ad ogni paziente inoltre è possibile combinando le biopsie liquide con le biopsie primarie standard del tessuto. L’intero genoma o l’intero sequenziamento dell’esoma della biopsia tumorale primaria consente la scoperta di mutazioni genetiche specifiche per il tumore di un paziente e può essere utilizzato per il successivo sequenziamento mirato del ctDNA del paziente. La più alta sensibilità di rilevazione di ctDNA è compiuta con l’ordinamento mirato a dei polimorfismi specifici del singolo nucleotide (SNPs). Geni comunemente mutati, come gli oncogeni, che in genere hanno mutazioni hotspot, sono buoni candidati per approcci di sequenziamento mirati. Al contrario, la maggior parte dei geni soppressori del tumore hanno una vasta gamma di possibili mutazioni di perdita di funzione in tutto il gene, e come tali non sono adatti per il sequenziamento mirato.

Gli approcci mirati hanno il vantaggio di amplificare il ctDNA attraverso reazioni a catena della polimerasi (PCR) o PCR digitale. Ciò è particolarmente importante quando si analizza il ctDNA non solo perché ci sono livelli relativamente bassi di DNA circolanti nel sangue, ma anche perché il ctDNA costituisce una piccola percentuale del DNA totale senza cellule estratto. Pertanto, l’amplificazione delle regioni di interesse può migliorare drasticamente la sensibilità del rilevamento del ctDNA. Tuttavia, l’amplificazione tramite PCR può introdurre errori dato il tasso di errore intrinseco delle DNA polimerasi. Gli errori introdotti durante l’ordinamento possono anche fare diminuire la sensibilità di rilevazione delle mutazioni di ctDNA.

Droplet Digital PCR (ddPCR)Edit

Questo metodo è derivato dalla PCR digitale, originariamente chiamata dal gruppo di Bert Vogelstein alla Johns Hopkins University. Droplet Digital PCR utilizza un generatore di goccioline per partizionare singoli pezzi di DNA in goccioline utilizzando un’emulsione olio/acqua. Poi le singole reazioni a catena della polimerasi accadono in ogni gocciolina facendo uso dei primer selezionati contro le regioni di ctDNA e procede all’endpoint. La presenza delle sequenze di interesse è misurata da sonde fluorescenti, che si legano alla regione amplificata. Il ddPCR consente una valutazione altamente quantitativa di allele e frequenze mutanti nel ctDNA, ma è limitato dal numero di sonde fluorescenti che possono essere utilizzate in un test (fino a 5). La sensibilità del test può variare a seconda della quantità di DNA analizzato ed è di circa 1 su 10.000.

Perline, emulsificazione, amplificazione e magnetismo (raggiante)Modifica

Questa tecnica si basa sulla PCR digitale delle gocce per identificare le mutazioni nel ctDNA utilizzando la citometria a flusso. Dopo ctDNA viene estratto dal sangue, PCR viene eseguita con primer progettati per indirizzare le regioni di interesse. Questi primer contengono anche sequenze di DNA specifiche, o tag. Il DNA amplificato viene miscelato con perline magnetiche rivestite con streptavidina ed emulsionato in goccioline. I primer biotinilati progettati per legarsi ai tag vengono utilizzati per amplificare il DNA. La biotinilazione consente al DNA amplificato di legarsi alle perle magnetiche, che sono rivestite con streptavidina. Dopo che la PCR è completa, le perle legate al DNA vengono separate usando un magnete. Il DNA sulle perle viene quindi denaturato e lasciato ibridare con oligonucleotidi fluorescenti specifici per ciascun modello di DNA. I complessi di perle-DNA risultanti vengono quindi analizzati utilizzando la citometria a flusso. Questa tecnica è in grado di catturare allele e frequenze di mutazione grazie all’accoppiamento con ddPCR. Tuttavia, a differenza di ddPCR, un maggior numero di sequenze di DNA può essere interrogato dovuto la flessibilità di usando le sonde fluorescently legate. Un altro vantaggio di questo sistema è che il DNA isolato può essere utilizzato anche per il sequenziamento a valle. La sensibilità è 1.6 in 104 a 4.3 in 105.

Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing (CAPP-Seq)Edit

Questo metodo è stato originariamente descritto dai gruppi di Ash Alizadeh e Maximilian Diehn alla Stanford University. Questa tecnica utilizza sonde selettrici oligonucleotidiche biotinilate per indirizzare le sequenze di DNA rilevanti per la rilevazione del ctDNA. I database sul cancro disponibili al pubblico sono stati utilizzati per costruire una libreria di sonde contro le mutazioni ricorrenti nel cancro calcolando il loro indice di recidiva. Il protocollo è stato ottimizzato per i bassi livelli di DNA osservati nella raccolta di ctDNA. Quindi il DNA isolato subisce un sequenziamento profondo per una maggiore sensibilità. Questa tecnica consente l’interrogatorio di centinaia di regioni del DNA. La sensibilità di rilevazione di ctDNA di CAPP-Seq è riferita per essere 2,5 molecole in 1.000.000.

Tag AMplicon deep Sequencing (TAM-Seq)Modifica

TAM-Seq consente il sequenziamento mirato di interi geni per rilevare mutazioni nel ctDNA. In primo luogo una fase di amplificazione generale viene eseguita utilizzando primer che coprono l’intero gene di interesse in sezioni 150-200bp. Quindi, un sistema microfluidico viene utilizzato per collegare adattatori con un identificatore univoco a ciascun amplicone per amplificare ulteriormente il DNA in reazioni singleplex parallele. Questa tecnica ha dimostrato di identificare con successo le mutazioni sparse nel gene soppressore del tumore TP53 in pazienti con cancro ovarico avanzato. La sensibilità di questa tecnica è 1 su 50.

Safe-Sequencing (Safe-Seq)Edit

Questo metodo è stato originariamente descritto da Bert Vogelstein e dal suo gruppo alla Johns Hopkins University. Safe-Seq diminuisce il tasso di errore del sequenziamento massicciamente parallelo al fine di aumentare la sensibilità ai mutanti rari. Raggiunge questo con l’aggiunta di un identificatore univoco (UID) sequenza per ogni modello di DNA. Il DNA viene quindi amplificato utilizzando gli UID aggiunti e sequenziato. Tutte le molecole di DNA con lo stesso UID (una famiglia UID) dovrebbero avere la stessa sequenza di DNA riportata poiché sono state amplificate da una molecola. Tuttavia, le mutazioni possono essere introdotte attraverso l’amplificazione, o assegnazioni di base errate possono essere chiamate nelle fasi di sequenziamento e analisi. La presenza dell’UID consente di separare questi errori metodologici dalle vere mutazioni del ctDNA. Una mutazione è considerata un ‘supermutante’ se il 95% delle letture sequenziate sono in accordo. La sensibilità di questo approccio è 9 in 1 milione.

Duplex sequencingEdit

Questo metodo è un miglioramento dei singoli UID aggiunti nella tecnica Safe-Seq. Nel sequenziamento duplex, il DNA randomizzato a doppio filamento agisce come tag unici e viene collegato a un distanziatore invariante. I tag sono attaccati ad entrambe le estremità di un frammento di DNA (tag α e β), che si traduce in due modelli unici per PCR – un filo con un tag α sull’estremità 5′ e un tag β sull’estremità 3′ e l’altro filo con un tag β sull’estremità 5′ e un tag α sull’estremità 3′. Questi frammenti di DNA vengono poi amplificati con primer contro le sequenze invarianti dei tag. Il DNA amplificato viene sequenziato e analizzato. Il DNA con gli adattatori duplex viene confrontato e le mutazioni vengono accettate solo se esiste un consenso tra entrambi i filamenti. Questo metodo tiene conto sia degli errori derivanti dal sequenziamento che degli errori derivanti dall’amplificazione della PCR in fase iniziale. La sensibilità dell’approccio alla scoperta dei mutanti è 1 in 10^7.

Integrated Digital Error Suppression (iDES)-enhanced CAPP-SeqEdit

iDES migliora l’analisi CAPP-Seq del ctDNA per diminuire l’errore e quindi aumentare la sensibilità di rilevamento. Segnalato in 2016, iDES combina CAPP-Seq con la tecnologia di sequenziamento del codice a barre duplex e con un algoritmo computazionale che rimuove gli errori stereotipati associati alla fase di ibridazione CAPP-Seq. Il metodo integra anche il sequenziamento duplex, ove possibile, e include metodi per il recupero duplex più efficiente dal DNA cellulare libero. La sensibilità di questa versione migliorata di CAPP-Seq è 4 in 100.000 copie.