Chimerismo test è utilizzato di routine per la documentazione di attecchimento e post-trapianto di follow-up del trapianto allogenico destinatari. Le cellule donatrici e riceventi possono essere distinte testando marcatori genetici determinati prima del trapianto.2 Nei trapianti di sesso non corrispondenti quando il ricevente e il donatore sono di sesso diverso, la proporzione di cellule femminili e maschili è solitamente determinata dall’analisi dei marcatori cromosomici sessuali, il più delle volte con i PESCI.8,9 La valutazione del numero variabile di ripetizioni tandem (VNTR) o brevi ripetizioni tandem (STR) mediante PCR è diventata il metodo più prezioso per la determinazione del chimerismo nei trapianti abbinati al sesso.10 Vari metodi sono stati sviluppati per il rilevamento di MRD. L’analisi morfologica del midollo può identificare la malattia residua che occupa più del 5% dello spazio del midollo e quindi manca della sensibilità necessaria per la diagnosi precoce. Inoltre, è spesso difficile differenziare una piccola popolazione di blasti leucemici da normali blasti ematopoietici derivati da donatori che ripopolano il midollo senza utilizzare marcatori aggiuntivi. Test specifici possono rilevare MRD quando c’è un marcatore tumorale specifico come una specifica anomalia citogenetica, un immunofenotipo specifico che può essere identificato da FACS, sequenze specifiche di DNA o RNA che possono essere amplificate da PCR o un modello di crescita specifico in saggi clonogenici. In assenza di un marcatore tumorale specifico per MRD, il test del chimerismo può essere utilizzato per rilevare le cellule derivate dal destinatario. Il rilevamento di cellule derivate dal ricevente potrebbe non essere sempre correlato al rischio di recidiva. Le cellule riceventi che contribuiscono al chimerismo misto (MC) appartengono al clone maligno o possono essere normali cellule ematopoietiche o anche cellule stromali. Durante le prime settimane dopo il trapianto allogenico standard le cellule riceventi possono ancora essere rilevate quando vengono utilizzati test sensibili.9,11 Queste sono per lo più cellule T che sopravvivono al regime di condizionamento. Le cellule ospiti possono essere rilevate a bassi livelli (< 1%) anche più tardi nel decorso post-trapianto. MC viene rilevato più spesso dopo condizionamento non mieloablativo.2 Pertanto, le sonde dei marcatori specifici del tumore sono probabilmente superiori e più accurate delle sonde di disadattamento del sesso per il rilevamento della MRD.12 Tuttavia, anche il rilevamento di MRD con test specifici per tumore potrebbe non essere sempre correlato al rischio di recidiva. Test PCR positivi per BCR / ABL sono stati riportati in individui sani.13 La traslocazione t (14; 18) è stata rilevata in lignaggi diversi dai linfociti B in pazienti con linfoma non Hodgkin.14 Potrebbe esserci una soglia per la MRD clinicamente significativa. In diverse malattie, come AML con t(8;21),15 remissioni di lunga durata sono state osservate in presenza di MRD rilevato dalla PCR, mentre in altri, come nella leucemia promielocitica acuta, la positività della PCR predice la ricaduta.16 Ancora una volta, ciò può essere correlato alla sensibilità del test PCR specifico e alla soglia di significatività clinica. Le cellule maligne residue possono essere in uno stato dormente17 privo del potenziale di contribuire alla ricaduta, a causa della mancanza o del guadagno di una seconda alterazione genetica. In alcune malattie la differenziazione parziale alle cellule più mature può accadere e queste cellule possono mancare il potenziale proliferare. MRD può essere sotto sorveglianza immunitaria, o le cellule MRD essere in una fase apoptotica rendendoli irrilevanti per recidiva della malattia. I test PCR sensibili non preservano la morfologia cellulare, e quindi non è chiaro quali cellule correlano con MRD in queste diverse impostazioni.
Il sistema Duet™ per analisi multiparametriche morfologiche e citogenetiche simultanee combinate offre alcuni vantaggi che possono aiutare a rivelare la rilevanza del rilevamento della MRD. Questo sistema cerca automaticamente un gran numero di cellule (circa 150000 cellule per vetrino) per piccoli sottoinsiemi cellulari con fenotipo citogenetico o immunitario unico. La sensibilità per il rilevamento di piccole popolazioni è aumentata. In una serie di esperimenti di diluizione abbiamo dimostrato che la sensibilità per il rilevamento di una cellula maschile in una popolazione di cellule femminili è superiore a 1:50000, tuttavia, a causa della specificità limitata in questo titolo, il miglior rilevamento avviene tra 1:10000 e 1:50000 (vedi appendice). Come visto nell’analisi di campioni di midollo osseo del paziente 1 (ultima analisi) e del paziente 2, il sistema Duet™ è in grado di rilevare popolazioni molto piccole di cellule riceventi XY non rilevate dai pesci di routine. L’accuratezza quantitativa dei PESCI dipende dalla frequenza osservata e dal numero di cellule segnate, quindi migliorata segnando più cellule.18 Il calcolo di un numero così elevato di cellule non è pratico con FISH manuale, ma il sistema automatico Duet™ è in grado di scansionare 10000 cellule/min in microscopia a campo luminoso e 2000-10000 cellule/h in microscopia fluorescente, supportando così la necessità di una scansione rapida ed efficiente e una maggiore sensibilità.
I test sensibili sono spesso associati a una ridotta specificità e a un tasso di falsi positivi relativamente elevato. Con PESCE standard punteggio falso positivo può verificarsi a causa di ibridazione aspecifica della sonda. Il punteggio falso positivo per le traslocazioni cromosomiche può verificarsi a causa dell’associazione spaziale casuale e della fusione ottica.18 Il sistema Duet ™ può potenzialmente migliorare la specificità identificando la morfologia delle cellule nella popolazione ricercata. Il rilevamento della positività dei PESCI, in una piccola popolazione ma con un aspetto morfologico Duet™ uniforme, rende più probabile che sia un vero positivo, rispetto a quando le cellule positive sono sparse all’interno di lignaggi diversi e non correlati. La specificità del rilevamento di MRD con test di chimerismo non specifico può anche essere migliorata. Come discusso sopra, le cellule riceventi possono appartenere al clone maligno (come nel paziente 1), possono essere cellule ematopoietiche normali (paziente 3, paziente 1 dopo il trattamento con STI571) o cellule non ematopoietiche/stromali (come osteoblasti, paziente 2). Il sistema Duet™ consente di differenziare queste opzioni in base all’aspetto morfologico. Abbiamo dimostrato nell’analisi del paziente 1, e di altri due pazienti (dati non mostrati), che l’identificazione delle caratteristiche del ricevente (come la citogenetica di genere opposto) all’interno di blasti o cellule immature predice una ricaduta palese e la precede di alcune settimane o di alcuni mesi. Nel paziente 1 analisi separate sui PESCI hanno rivelato una piccola popolazione ricevente XY (0,6%) e una piccola popolazione positiva BCR/ABL (0,8%) che potevano essere considerate entrambe all’interno del tasso di falsi positivi dell’analisi sui PESCI. Tuttavia, il sistema Duet™ ha dimostrato che gran parte delle cellule riceventi XY erano blasti (e anche BCR/ABL positivi da un secondo test FISH sulle stesse cellule) e potrebbe quindi prevedere che il paziente è destinato a ricadere. L’identificazione di una piccola popolazione ricevente all’interno di cellule ematopoietiche mature potrebbe non prevedere la ricaduta. In tre pazienti aggiuntivi (dati non mostrati) abbiamo documentato la remissione continua in presenza di una piccola popolazione ricevente con morfologia matura. Sono necessari studi su larga scala con un follow-up più lungo per confermare l’associazione tra morfologia delle cellule ospiti residue e rischio di recidiva in pazienti senza altri marcatori unici per il clone maligno.
Il sistema è relativamente semplice da utilizzare, è per lo più automatico, i suoi tempi di uscita e costi sono paragonabili ad altri sistemi per il chimerismo e il rilevamento MRD come standard FISH e PCR e può essere adatto per test su larga scala. Oltre all’hardware e ai kit del sistema è necessaria solo l’attrezzatura standard prontamente disponibile nei grandi laboratori (vedi appendice).
Negli ultimi anni lo studio del chimerismo all’interno di diversi sottoinsiemi cellulari ha guadagnato interesse e popolarità.19,20 Questo è della massima importanza dopo i trapianti non mieloablativi.2 È stato dimostrato da alcuni gruppi che il chimerismo completo all’interno dei linfociti T è richiesto per l’induzione di GVL, e quindi la MC in questo sottoinsieme cellulare può essere associata ad un aumentato rischio di recidiva, specialmente di neoplasie aggressive e in rapida crescita.2,19 Il test del chimerismo dei sottoinsiemi cellulari richiede uno smistamento ingombrante e dispendioso in termini di tempo delle cellule con il potenziale teorico di perdere alcune cellule durante tale processo. Come discusso nell’appendice, la preparazione dei vetrini per l’analisi Duet™ non causa perdita o riduzione di alcuna popolazione cellulare. Il sistema Duet ™ utilizza il vetrino macchiato MGG per localizzare linfociti e altri sottoinsiemi cellulari e può anche utilizzare macchie immunocitochimiche (come gli anticorpi monoclonali anti-CD3) per localizzare queste cellule. In una seconda fase, il PESCE può essere applicato per il test del chimerismo nei trapianti non corrispondenti al sesso. La presentazione del caso del paziente 3 mostra come il sistema è stato utilizzato per seguire il chimerismo in un paziente dopo trapianto non mieloablativo e come la conversione al chimerismo completo dopo sospensione della ciclosporina predisse l’insorgenza di risposte GVHD e GVT.
Questo rapporto si concentra sull’uso di Duet™ dopo il trapianto di midollo osseo, tuttavia, ci possono essere molte altre implicazioni. Il sistema può anche aiutare a studiare le cellule e le linee che ospitano un marcatore citogenetico o immunofenotipico unico, come la fusione BCR/ABL (come visto nel paziente 1) e correlare la loro morfologia con il rischio di recidiva dopo la chemioterapia standard. Può aiutare a rivelare la natura della MRD in diverse neoplasie maligne e perché il rilevamento della MRD non è sempre predittivo della ricaduta. In alcune impostazioni piccole popolazioni di cellule donatrici o micro-chimerismo possono essere ricercate. Ad esempio, il microchimerismo linfoemopoietico sistemico rilevato dopo il trapianto di organi solidi può prevedere la tolleranza all’organo trapiantato e dirigere la terapia immunosoppressiva.21 Anche una piccola popolazione materna contaminante allotrapianti di sangue cordonale può essere rilevata in modo simile e può avere implicazioni sul rischio post-trapianto per la GVHD.
In conclusione, aggiungendo l’analisi morfologica di piccole popolazioni di cellule con tumore maligno o marcatori associati al ricevente, il sistema Duet™ può migliorare l’accuratezza dei test di chimerismo e MRD e delineare il loro significato clinico. Questo sistema merita ulteriori studi in studi su larga scala.