Chimere

Cosa fornirai Parte I

• Un numero di conto.
• Una linea cellulare ES priva di micoplasmi con 40 cromosomi.

Cosa faremo

• Inietteremo circa 50 blastocisti per linea cellulare ES. Questo dovrebbe portare a 10 topi nati. Tre dei topi dovrebbero essere forti chimere maschili. Abbiamo una comprovata esperienza di successo.
• Ospiteremo i topi fino allo svezzamento (tre settimane dopo la nascita).

Cosa fornirai Parte II

• Ospiterai i topi svezzati.

Costo

• $3.300 per linea cellulare 129 e il costo delle femmine donatrici; $4.950 per linea cellulare e il costo delle femmine donatrici per altri background genetici.
• Gli ordini locali non CWRU verranno addebitati ulteriori mice 200 per l’imballaggio e il trasporto di topi. Gli ordini non locali saranno addebitati $200 e le spese di trasporto.

Conformità normativa

• Gli investigatori hanno bisogno di un protocollo IACUC dalla loro istituzione per ricevere i topi dal core. I protocolli CWRU IACUC devono specificare l’uso del core transgenico del caso. I ricercatori non hanno bisogno di un proprio protocollo IBC, normalmente: la revisione per il DNA ricombinante negli animali sarà condotta sulle informazioni presentate attraverso l’ordinazione online per il nucleo transgenico e sarà aggiunta al protocollo IBC del nucleo come emendamento se approvato. È possibile essere contattati dall’IBC per ulteriori informazioni come parte della revisione rDNA dopo l’invio dell’ordine. L’approvazione di IBC è richiesta prima di iniziare le iniezioni.

Ringraziamenti

• Ti chiediamo di riconoscere il Caso transgenico e la struttura di targeting in seminari e pubblicazioni.

Timeline

• Dalla data di iniezione delle cellule, ci vorranno almeno 6 settimane prima che saremo in grado di consegnare i topi (quasi 3 settimane per la gestazione e almeno 3 settimane di crescita postnatale prima dello svezzamento). Saranno altre 6 settimane prima che le chimere maschili siano abbastanza grandi da riprodursi, e un minimo di altre 6 settimane prima che tu abbia svezzato la prole al genotipo per testare la trasmissione della linea germinale-un totale di 4.5 mesi dall’iniezione al test per la trasmissione della linea germinale.
• Il tempo previsto (3/25/21) tra il posizionamento dell’ordine e l’iniezione di celle ES è di 8 settimane. Durante le 8 settimane prima dell’iniezione, la richiesta di chimera viene esaminata dal comitato rDNA dell’IBC, le cellule ES vengono scongelate e coltivate e i topi vengono ordinati e ricevuti.

Tasso di successo nella generazione di topi chimerici

Il nucleo genera una media di circa 5 chimere per linea cellulare.

Introduzione
La probabilità di trasmissione germinale di una mutazione mirata aumenta con il numero di linee cellulari ES indipendenti disponibili. In media, circa due terzi a tre quarti delle linee cellulari ES sul background genetico 129 andranno linea germinale. Per le linee cellulari ES sullo sfondo C57, una media di solo la metà a due terzi delle linee andrà germline. Pertanto, se si acquistano linee cellulari ES mirate da un repository pubblico, si consiglia di acquistare 3 o più linee mirate correttamente sullo sfondo 129 e 4 o più linee sullo sfondo C57. Allo stesso modo, ordinare 2 o più iniezioni per 129 linee e 3 o più per linee C57. Per la generazione di knockout specifici del tessuto con alleli condizionali nelle cellule ES di EUCOMM, vedere il nostro primer.

Domande frequenti

Che cosa sono le chimere?
Tipicamente, le chimere sono costruite per generare topi da linee cellulari ES gene-mirate o intrappolate dal gene. Le cellule ES iniettate negli embrioni ospiti danno origine a topi mosaico noti come chimere.
Le cellule ES maschili vengono iniettate in blastocisti non sessate. Se l’embrione ospite è femmina e le cellule ES maschili formano cellule germinali, la chimera sarà spesso un maschio fertile. Vengono utilizzati embrioni ospiti provenienti da un ceppo che non competerà troppo fortemente con le cellule ES e le due componenti (ES e embrione ospite) sono marcate geneticamente con geni del colore del mantello in modo che il contributo delle cellule ES all’animale possa essere determinato facilmente. Se la proporzione di discendenti di cellule ES nel mantello dell’animale è alta, è anche alta la probabilità che le cellule ES siano rappresentate nei gameti, poiché le cellule ES si mescolano accuratamente con le cellule ospiti all’inizio dell’embriogenesi. Il sistema di marcatura del colore del mantello consente inoltre di determinare, con opportune croci, se la prole delle chimere proviene dalla componente cellulare ES o dalla componente embrionale ospite.

129 cellule ES danno origine al colore del mantello marrone perché sono A / A (wild type Agouti) e gli embrioni ospiti C57BL/6J danno origine al colore del mantello nero perché sono a/a (recessive nonagouti). Le cellule ES provengono dal ceppo 129 dei topi; gli embrioni ospiti provengono dal ceppo C57BL / 6J dei topi. Se queste chimere sono allevate in topi a/a non agouti (ad esempio C57BL/6J, allora qualsiasi prole marrone (A/a) deve essere sorto da gameti derivati da cellule ES e il 50% della prole marrone dovrebbe portare l’allele knockout. In alternativa, la trasmissione della mutazione può essere dosata direttamente mediante PCR o test Southern blot di tessuti dalla prole.
Se le cellule ES provengono dal ceppo C57BL/6J (a/a, Tyr/Tyr e nero), l’embrione ospite sarà albino C57BL/6J (a/a, Tyrc-2J/Tyrc2-J e bianco). L’allevamento di tali chimere all’albino C57BL/6J può generare prole nera (a/a, Tyr/Tyrc-2J) dalla componente cellulare ES, il 50% dei quali dovrebbe portare la mutazione, e prole bianca (a/a, Tyrc-2J / Tyrc-2J) dalla componente dell’embrione ospite.
Le chimere maschili che possono trasmettere la mutazione mirata possono essere identificate mediante genotipizzazione copulatoria.

Chimere per altri usi
Realizziamo anche chimere di aggregazione e chimere diploidtetraploidi. Due embrioni preimpianto da due diversi ceppi di topi sono combinati per formare una chimera aggregazione. Questa tecnologia può essere utilizzata per generare embrioni di mosaico genetico per l’analisi dell’autonomia e della non autonomia dell’azione genica e altri obiettivi sperimentali. Nelle chimere diploidtetraploidi, la componente tetraploide dà origine in gran parte alla placenta derivata dall’embrione e alla componente diploide dell’embrione. Questo tipo di chimera può essere utilizzato per determinare se è richiesto un gene nella placenta o nell’embrione.

Perché i miei topi sono divertenti colori?
Alcune linee cellulari ES sono eterozigoti per gli alleli di colore del mantello che si rivelano solo nelle generazioni successive. Le cellule R1 129 ES che usiamo sono eterozigoti al locus albino, portando una copia dell’allele chinchilla di albino (cch, anche designato Tyrc-ch) e sono eterozigoti al locus di diluizione dagli occhi rosa (p). Riproduzione prole disceso da cellule R1 ES tra loro può dare origine a topi che sono neri, diverse tonalità di grigio, diverse tonalità di marrone, o giallo, a seconda della gamma di alleli colore del mantello.

Cosa si può fare per garantire la trasmissione germline?
La trasmissione germinale è massimizzata con cellule ES che hanno trascorso un minimo di tempo in coltura, che hanno un normale complemento di cromosomi e che sono prive di lievito, batteri e micoplasma. Indirizzare una linea cellulare che si sa viene trasmesso nelle vostre condizioni al vostro istituto. Utilizzare una linea cellulare parentale con il numero di passaggio più basso disponibile (preferibilmente inferiore al numero di passaggio 16). Ridurre al minimo il tempo in cui la linea mirata viene coltivata. Verificare che le linee cellulari mirate abbiano il numero normale di cromosomi. Prova la tua linea cellulare per micoplasma. Alcune linee cellulari non trasmetteranno anche quando tutti questi parametri sono a tuo favore. Anche in condizioni ottimali, solo due terzi delle linee cellulari ES mirate saranno trasmesse attraverso la linea germinale. Pertanto, iniziare con almeno tre linee cellulari mirate indipendenti per garantire la trasmissione.

Ho chimere deboli/chimere femminili. Trasmetteranno il knockout?
Sia le chimere deboli che le chimere femminili possono trasmettere alleli mutanti, anche se raramente. Le chimere maschili che possono trasmettere la mutazione mirata possono essere identificate mediante genotipizzazione copulatoria. Solo circa il 10% delle chimere femminili trasmettono il genoma delle cellule ES, quando lo fanno è solo nelle prime cucciolate, e molti dei loro figli maschi hanno aneuploidie cromosomiche sessuali che li rendono sterili (Bronson et al., 1995 PNAS 92, 3120).

Perché sono morte le mie chimere più forti?
La mortalità può aumentare con la proporzione dell’animale che proviene dalle cellule ES, anche per le migliori linee cellulari. Questa mortalità è dovuta in gran parte alle aberrazioni epigenetiche sorte nella cultura. Si pensa che le aberrazioni epigenetiche siano corrette dal successivo allevamento di topi sopravvissuti e si separerebbero casualmente dal locus mirato, anche se non lo fossero.

A quale ceppo di topi allevo i miei mutanti?
Per ridurre al minimo la variabilità genetica il più rapidamente possibile, alleva le chimere sullo stesso sfondo delle cellule ES. Se le cellule ES fossero 129, alleva le chimere a 129 topi e la tua mutazione sarà completamente sullo sfondo di 129 inbred in un solo passaggio. Lo sfondo inbred più comune per gli studi genetici è il ceppo C57BL / 6. Se le tue cellule ES sono C57BL/6, incrocia le chimere con i topi C57BL / 6J. Se si desidera modificare lo sfondo, lo standard è quello di fare 9 croci seriali al ceppo inbred di scelta (circa 2,5 anni). La logica per le generazioni 9 è spiegata qui da Lee Silver. In alternativa, circa la metà del numero di generazioni è richiesto da backcross marker-assisted, o congenics velocità.Per la massima riproduzione, incrocia i tuoi topi su un ceppo outbred come CD1. I topi CD1 sono stati derivati da topi svizzeri, hanno un alto grado di variazione genetica e sono stati selezionati per una riproduzione robusta.

Celle ES con alleli condizionali di EUCOMM
Ogni linea cellulare di EUCOMM richiederà di completare un Accordo di trasferimento dei materiali. Inizia questo processo il prima possibile.
Il tempo di generazione dei topi e il numero di croci necessari per generare i topi sperimentali si combinano per un periodo di tempo che è sorprendente per quelli non abituati alla genetica dei topi, quindi pianifica in anticipo. Il tempo di generazione dei topi (il tempo da adulto sessualmente maturo a prole sessualmente matura) è di circa 3 mesi.
Gli alleli condizionali EUCOMM hanno tipicamente una cassetta fiancheggiata da Frt (una cassetta “Frt-ed”). La cassetta ha un accettore della giuntura che devia virtualmente tutto lo splicing nella cassetta, rendente all’allele una mutazione di perdita di funzione in questa configurazione. Per generare l’allele condizionale, la cassetta Frt-fiancheggiata deve essere rimossa incrociando i topi che esprimono Flpe. Il sistema Flpe / Frt è comparabile ma distinto dal sistema Cre/LoxP.
Inietteremo le cellule ES in embrioni ospiti per creare topi chimerici. Da lì, alleverai i topi per generare topi portatori della mutazione (trasmissione germinale). Questa generazione di topi fondatore può essere incrociata con topi che esprimono Flpe per rimuovere la cassetta Frt-ed, generando l’allele condizionale. Quindi, è necessario fare molte altre croci per generare i topi sperimentali.

1. Dall’iniezione di cellule ES alle chimere adulte sessualmente mature è il tempo di generazione dei topi (3 mesi).
2. Le chimere vengono allevate in topi di tipo selvaggio per stabilire il mutante nella linea germinale (3 mesi).
3. I topi condizionali eterozigoti frtd sono incrociati a Flpe che esprimono omozigoti. Questo genera Flpe/ o, frtd condizionale / + prole. (3 mesi)
4. I topi Flpe/o, frtd condizionali/+ sono incrociati al tipo selvaggio per stabilire l’allele asportato nella linea germinale e allevare via Flpe, e l’escissione è verificata molecolarmente in questi topi condizionali/+ (3 mesi).
5. I topi condizionali/+ si sono poi allevati l’un l’altro per creare topi allele condizionali omozigoti (3 mesi).
6. I topi condizionali/condizionali sono allevati in topi tissutali-specifici-Cre/tissue-specific-Cre, null/+ per rendere sperimentali i topi tissutali-specifici-Cre/o, condizionali/null, e controllare i topi tissutali-specifici-Cre/o, condizionali/+.

Inoltre, i topi Fple, null, Cre devono essere ottenuti, i topi tissue-specific-Cre/tissue-specific-Cre, null/+ devono essere allevati.
Inoltre, l’allele condizionale dovrebbe essere analizzato per determinare se è di tipo wild in funzione prima dell’escissione con Cre e null dopo l’escissione con Cre. Per determinare se l’allele condizionale è di tipo selvaggio in funzione prima dell’escissione, i mutanti condizionali/condizionali e condizionali/null dovrebbero essere esaminati per determinare se il loro fenotipo è lo stesso dei topi +/+ e null/+ rispettivamente. Per determinare se il condizionale Cre-asportato è un allele nullo, il condizionale viene incrociato con un topo Cre germinale e i condizionali asportati vengono incrociati per verificare se il fenotipo del condizionale asportato/escisso condizionale è lo stesso di null/null e/o che nessuna proteina è prodotta dall’allele condizionale asportato.
Un reporter di attività Cre come RosaReporter, o più idealmente, che mostra direttamente che la proteina di interesse è assente dalle cellule bersaglio per immunofluorescenza è un controllo importante. RosaReporter genera espressione beta-galattosidasi permanente in tutte le cellule che sono state esposte a Cre.
Un’eccessiva espressione di Cre può portare alla rottura del cromosoma che può causare fenotipi non correlati alla funzione dell’allele condizionale. Pertanto, i topi fratelli che esprimono Cre ma mantengono una certa funzione genica (ad esempio, condizionale/+) sono un controllo importante.