Il processo di applicazione dell’imaging CLARITY inizia con un campione di tessuto post-mortem. Successivamente una serie di trattamenti chimici deve essere applicata per ottenere la trasparenza, in cui il contenuto lipidico del campione viene rimosso, mentre quasi tutte le proteine originali e gli acidi nucleici vengono lasciati al loro posto. Lo scopo di questo è quello di rendere il tessuto trasparente e quindi suscettibile di indagine microscopica dettagliata delle sue parti funzionali costituenti (che sono prevalentemente proteine e acidi nucleici). A tal fine, la struttura proteica preesistente deve essere collocata in un’impalcatura trasparente che la preserva, mentre i componenti lipidici vengono rimossi. Questo ‘ponteggio’ è costituito da monomeri di idrogel come l’acrilammide. L’aggiunta di molecole come formaldeide, paraformaldeide o glutaraldeide può facilitare il fissaggio dell’impalcatura alle proteine e agli acidi nucleici che devono essere conservati e l’aggiunta di calore è necessaria per stabilire i legami effettivi tra i componenti cellulari e l’acrilammide.
Una volta completato questo passaggio, i componenti proteici e degli acidi nucleici delle cellule del tessuto bersaglio vengono tenuti saldamente in posizione, mentre i componenti lipidici rimangono staccati. I lipidi vengono quindi rimossi per 1-2 settimane di diffusione passiva nel detergente o accelerati con metodi elettroforetici solo per ore o giorni. Durante il loro passaggio, le proprietà lipofile del detergente gli consentono di raccogliere e asportare tutti i lipidi incontrati lungo il percorso. I coloranti lipofili come DiI vengono rimossi, tuttavia ci sono coloranti lipofili compatibili con la CHIAREZZA che possono essere fissati alle proteine vicine. La grande maggioranza delle molecole non lipidiche, come proteine e DNA, rimane inalterata da questa procedura, grazie al gel di acrilammide e alle proprietà chimiche delle molecole coinvolte.
Come riportato nel documento iniziale, il tessuto si espande durante questo processo, ma se necessario può essere ripristinato alle sue dimensioni iniziali con una fase finale di incubazione nella soluzione di corrispondenza dell’indice di rifrazione.
In questa fase del processo, il campione è stato completamente preparato per l’imaging. Il contrasto per l’imaging può provenire da molecole fluorescenti endogene, da etichette di acido nucleico (DNA o RNA) o da immunostenere, per cui vengono utilizzati anticorpi che si legano specificamente a una determinata sostanza bersaglio. Inoltre, questi anticorpi sono etichettati con etichette fluorescenti che sono la chiave per il risultato finale dell’imaging. I metodi standard di imaging confocale, a due fotoni o a fogli di luce sono tutti adatti per rilevare la fluorescenza emessa fino alla scala di localizzazione delle proteine, risultando così nelle immagini finali altamente dettagliate e tridimensionali prodotte dalla CHIAREZZA.
Dopo che un campione è stato immunostenuto per un’immagine, è possibile rimuovere gli anticorpi e riapplicarne di nuovi, consentendo così a un campione di essere ripreso più volte e mirando a più tipi di proteine.